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Affichage phagemide

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Si j'utilise un bactériophage pour l'affichage des phages et que j'essaie d'éviter les effets d'avidité en utilisant un phage auxiliaire, quel serait le meilleur moyen de conserver une grande taille de bibliothèque tout en gardant tout monomère ? Je demande en termes de maintien d'un taux d'infection approprié et/ou d'astuces et d'outils de phage pour maintenir cette stoechiométrie.


J'ai trouvé un article dans Nature :

Un phage auxiliaire pour améliorer la présentation des anticorps monocaténaires dans la présentation sur phage

protocole experimental

Les procédures de clonage standard, la détermination des unités formant des colonies et des unités formant des plages, et l'immunotransfert après PAGE ont été effectuées selon Sambrook et al.

Construction de la lignée cellulaire d'emballage.

DH5alpha/pIII [M13KO7DeltapIII]. Le gène M13 pIII fusionné au promoteur P/A1/04/03 (réf. 17) a été inséré dans le site de clonage multiple du plasmide lambdaattP pLDR9 (réf. 18). L'origine de réplication et le gène de résistance à la kanamycine ont été coupés et l'ADN non réplicatif de lambdaattP-pIII restant a été religaturé. Escherichia coli DH5alpha contenant le plasmide pLDR8 (réf. 18) ont été transformés avec l'ADN non réplicatif de lambdaattP-pIII et étalés sur des plaques de gélose contenant 25 tasses/ml d'ampicilline. Après incubation pendant une nuit à 42°C, les colonies obtenues ont été répliquées sur plaque et des clones résistants à l'ampicilline ont été identifiés, nommés E. coli DH5alpha/pIII. Ils ont ensuite été transformés avec M13KO7DeltapIII, résultant en la lignée cellulaire d'encapsidation E. coli DH5alpha/pIII [M13KO7DeltapIII].

Production de phages.

Pour obtenir le phage auxiliaire M13KO7DeltapIII, l'ADN de M13KO7DeltapIII a été électrotransfecté dans E. coli K802 contenant pNDI (réf. 15). Pour obtenir un hyperphage, l'ADN de M13KO7DeltapIII a été électrotransfecté dans E. coli DH5alpha/pIII. Les phages ont été produits par culture en présence de 0,5 mM d'isopropyl-bêta-D-thiogalactoside (IPTG) à 30°C pendant 24 h avec agitation à 200 tr/min. Escherichia coli Top10F' ou E. coli Xl1blue portant le phagemide pSEXphOx(Yol) ou une bibliothèque scFv dans pSEX81, respectivement, ont été infectés avec une préparation de phage auxiliaire à une DO600 de 0,1 à une multiplicité d'infection de 20 comme décrit.

Quantification des phages par ELISA.

Des séries de dilution de phages ont été enrobées dans 100 mM de NaHC03, pH 8,6 dans des plaques ELISA MaxiSorb (Life Technologies, Karsruhe, Allemagne) pendant 16 h à 4°C. Le blocage a été effectué avec de la poudre de lait écrémé à 2 % dans du PBS (137 mM NaCl, 3 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1 mM KH2PO4, pH 7,3) pendant 2 h à température ambiante. Les phages ont été détectés avec l'anticorps monoclonal de souris B62-FE2 (Progen, Heidelberg, Allemagne) liant spécifiquement un épitope sur la protéine d'enveloppe majeure pVIII du phage M13. Le phage M13KO7 d'unités formant des colonies connues a été utilisé pour la standardisation.

Immunoblot.

Environ 1010 phages ont été appliqués par piste sur un gel de polyacrylamide à 10 %. Le blocage a été effectué avec de la poudre de lait écrémé à 2 % dans du PBS pendant 2 h à température ambiante. L'immunocoloration a été réalisée avec le mAb de souris anti-g3p (MoBiTec, Göttingen, Allemagne) reconnaissant la protéine d'enveloppe pIII de M13KO7, visualisée avec le substrat 3,3', 5,5'-tétraméthylbenzidene (TMB) (Promega, Madison, WI).

ELISA de phage de liaison à l'antigène.

Des séries de dilution d'antigène BSA-phOx dans 100 mM de NaHC03, pH 8,6, ont été enrobées dans des plaques MaxiSorb ELISA (Life Technologies) pendant 16 h à 4°C. Après blocage de la liaison non spécifique avec 2 % de poudre de lait écrémé en PBS pendant 2 h à température ambiante, 2 fois 109 phages monocaténaires dilués dans 2 % de poudre de lait écrémé en PBS ont été appliqués dans chaque puits pendant 1 h à température ambiante. Après lavage six fois avec 400 ul de PBS par puits, les phages liés ont été détectés avec mAb B62-FE2 comme décrit ci-dessus.

Panoramique.

Une bibliothèque de fragments scFv humains dans pSEX81 avec une complexité maximale calculée de 2 fois 107 a été générée à partir de préparations de lymphocytes périphériques comme décrit21. La toxine tétanique obtenue auprès de Virotech (Rüsselsheim, Allemagne) a été appliquée sur six puits ELISA (Life Technologies) à une concentration de 0,1 tasse/ml dans 100 mM de NaHC03, pH 8,6, pendant 16 h à 4°C. Les puits ont été bloqués avec du lait écrémé à 2 % dans du PBS pendant 2 h à température ambiante, après quoi 1011 phages de la banque ont été appliqués à chaque puits et incubés à 4°C pendant une nuit. Après cinq lavages avec du PBS/0,1 % de Tween et cinq avec du PBS, les phages liés ont été élués avec 1 tasse/ml de trypsine (Life Technologies) dans du PBS pendant 15 min à température ambiante. Les phages élués ont été utilisés pour l'infection de 20 ml de E. coli XL1blue à une DO600 de 0,4. Les bactéries infectées ont été cultivées sur des plaques de gélose Luria-Bertani contenant du glucose et de l'ampicilline, grattées des plaques et utilisées pour la production de phages d'anticorps pour le prochain cycle de panoramique comme décrit précédemment.


Le premier cas décrit de Phage Display s'est produit en 1985, lorsque George P. Smith a fusionné un peptide avec un gène III d'un phage filamenteux. Il a déposé un brevet détaillant le processus de génération de bibliothèques de phage display la même année. Finalement, le développement ultérieur de la technologie Phage Display dirigé par différents groupes du Laboratoire de biologie moléculaire du MRC, ainsi que du Scripps Research Institute, a conduit à la possibilité d'afficher des protéines à des fins d'ingénierie thérapeutique des protéines. La technique a été continuellement améliorée pour cribler et amplifier d'énormes collections de protéines montrant mieux la connexion du phénotype et du génotype.

Un phage filamenteux a un diamètre d'environ 6,5 nanomètres, avec une longueur qui dépend de la taille de son génome. Il provient d'une immense famille de virus bactériens qui infectent également d'autres formes de bactéries. Il contient un petit génome avec une région intergénique contenant les séquences nécessaires à la réplication et à l'encapsidation de l'ADN.

Une particule de phage est constituée de cinq protéines d'enveloppe. La particule a un tube creux qui abrite autant de copies de la protéine d'enveloppe primaire. Il existe également des interactions de liaison entre les sections médianes hydrophobes des sous-unités adjacentes. Une extrémité de la particule est émoussée et l'autre est pointue. L'extrémité franche contient de nombreuses copies des deux plus petites protéines traduites par le ribosome, tandis que l'extrémité pointue ne contient qu'environ 5 copies des gènes pIII et pVI, qui sont nécessaires au détachement du phage de la membrane cellulaire.


Contenu

La présentation sur phage a été décrite pour la première fois par George P. Smith en 1985, lorsqu'il a démontré la présentation de peptides sur un phage filamenteux en créant la fusion de la protéine de capside du virus à une bibliothèque de séquences peptidiques. Cela affichait les peptides sur la surface virale, où ceux qui avaient la plus haute affinité de liaison pouvaient être sélectionnés. En 1988, Stephen Parmley et George Smith ont décrit le biopanning pour la sélection par affinité et ont démontré que des cycles de sélection récursifs pouvaient enrichir les clones présents à 1 sur un milliard ou moins. Γ] En 1990, Jamie Scott et George Smith ont décrit la création de grandes bibliothèques de peptides aléatoires affichées sur des phages filamenteux. La technologie d'affichage des phages a été développée et améliorée par des groupes du Laboratoire de biologie moléculaire avec Greg Winter et John McCafferty, l'Institut de recherche Scripps avec Lerner et Barbas et le Centre allemand de recherche sur le cancer avec Breitling et Dübel pour l'affichage des protéines tels que les anticorps pour l'ingénierie des protéines thérapeutiques. Smith et Winter ont reçu la moitié du prix Nobel de chimie 2018 pour leur contribution au développement de la présentation sur phage. Ε] Un brevet de George Pieczenik revendiquant la priorité de 1985 décrit également la génération de bibliothèques de peptides. Ζ]


Qu'est-ce qu'un phagemide (Phasmide)?

Phagemide, également appelé Phasmide, est aussi un type de vecteur hybride. Le phagemide contient une origine de réplication spéciale appelée origine de réplication f1. L'origine de réplication f1 est extraite d'un phage f1.

Le phagemide peut répliquer à la fois l'ADN simple brin et double brin. La réplication peut avoir lieu sous forme de plasmide tout en subissant une réplication indépendante ou peut être emballée dans des particules de phage et finalement infecter l'hôte bactérien E. coli. Lors de l'infection du E. coli cellules, le phage f1 nécessite la présence d'un pilus. Par conséquent, les pili sexuels sont importants pendant in vitro emballage de Phagemids.


DISCUSSION

Malgré l'énorme attention portée à la présentation sur phage médiée par pIII et pVIII, aucun rapport publié pour pVII et pIX n'existait. Comme décrit ici, il a été démontré que pVII et pIX pouvaient être utilisés pour afficher le peptide Flag lorsqu'ils étaient fusionnés aux extrémités N des deux protéines d'enveloppe. Ensuite, de manière plus significative, nous avons montré que les régions variables d'anticorps fusionnées à pVII et pIX s'engageaient dans une interaction dynamique pour afficher un anticorps Fv fonctionnel, un motif hétérodimère représentatif.

Les protéines d'enveloppe pIII, pVI, pVIII, pVII et pIX sont des protéines membranaires internes intégrales avant assemblage (24). Avec l'avènement de nos résultats, tous les cinq ont maintenant été utilisés pour afficher des protéines à la surface du phage. D'autres chercheurs ont montré que pVII et pIX étaient présents sous forme de cinq molécules situées à la même extrémité de la particule de phage qui a émergé en premier de la cellule et étaient nécessaires à l'initiation de l'assemblage par interaction avec le signal d'encapsidation du génome du phage (11). L'absence de pVII et de pIX a entraîné une production extrêmement faible de phage. Bien qu'il ait été suggéré précédemment que pVII et pIX n'étaient pas fonctionnels avec une autre protéine fusionnée à leurs terminaisons N (24), notre enquête a montré que de telles fusions étaient viables. Les raisons possibles de notre succès étaient que (je) une séquence leader a été incorporée qui ciblait les protéines de fusion vers la membrane interne et empêchait l'accumulation dans le cytoplasme et (ii) les pVII et pIX de type sauvage du phage auxiliaire ont été utilisés pour entrer en compétition avec les protéines de fusion pVII et pIX. Avec le succès de nos travaux, pVII et pIX devraient être facilement applicables aux protocoles combinatoires de présentation de phages utilisant des séquences protéiques très diverses.

Le marquage à l'or spécifique du phage Fv déterminé par microscopie électronique a clairement montré la présence d'or à une extrémité de la particule de phage. Fait intéressant, des phages qui hébergeaient un ou deux marqueurs d'or ont été observés. Nous supposons que ce dernier résultait de l'affichage bivalent de fragments Fv, plutôt que de multiples marquages ​​à l'or de PCP-BSA. Environ 20 % des phages étaient marqués à l'or et, par conséquent, présentaient un anticorps Fv fonctionnel. Cependant, une analyse cinétique a montré que l'activité de 150 nM de 21H3 phage Fv était égale à l'activité de 50 nM d'IgG 21H3. Les données, prises ensemble, ainsi que l'hypothèse selon laquelle les activités spécifiques du Fv et de l'IgG étaient comparables, suggéraient que certaines particules de phage présentaient simultanément plus d'un fragment Fv. Un affichage multivalent de fragments Fv à l'extrémité C terminale de pIII a été montré précédemment (23). De plus, la modulation des conditions de croissance a entraîné des valences altérées de la présentation des anticorps (25) et, par conséquent, notre induction avec 1 mM d'isopropyl β-d-thiogalactopyranoside pourrait bien augmenter la possibilité de multivalence.

Les fragments Fv sont des hétérodimères constitués de VH et VL domaines et sont les plus petits fragments d'anticorps qui contiennent toutes les informations nécessaires à la liaison spécifique à l'antigène. Cependant, les chaînes associées de manière non covalente dans un fragment Fv isolé ne sont pas très stables et ont tendance à se dissocier (26). Les procédés connus pour stabiliser les fragments Fv sont les Fv monocaténaires (scFvs) (1, 27, 28) et les Fv stabilisés au disulfure (dsFvs) (29-31). Pourtant, les scFv sont encore souvent instables (29, 32, 33) et peuvent avoir des affinités inférieures par rapport aux Fab et aux IgG entières car le lieur interfère avec la liaison ou ne stabilise pas suffisamment l'hétérodimère (30, 34, 35). Bien que les dsFv soient généralement plus stables et n'aient pas de lieur, ils nécessitent l'incorporation d'un disulfure dans la construction de la bibliothèque. De plus, il est probable que les bibliothèques dsFv couvrent un sous-ensemble d'anticorps biaisés dans lequel le disulfure interchaîne n'interfère pas avec la liaison à l'antigène (35). L'anticorps Fv affiché par pVII et pIX dans notre format peut être considéré comme un Fv stabilisé par phage (psFv) qui imite la structure naturelle de l'anticorps sans les inconvénients des scFv et dsFv. Nos Fv conservent leur affinité et sont robustes, en ce sens que chaque chaîne est ancrée indépendamment à la couche de phage.

Plus important encore, notre nouveau format serait particulièrement utile pour l'affichage combinatoire de matrices hétérodimères. De plus, bien que les raisons ne soient pas encore claires, ce format semble apporter un enrichissement particulièrement puissant lors des protocoles de panoramique. Le pVII et le pIX sont apparemment assez proches pour les protéines de fusion avec le VH et VL d'un anticorps pour former un hétérodimère fonctionnel. Nous prévoyons pleinement que l'approche peut être étendue à la présentation de divers polypeptides pour la création d'anticorps artificiels. La capacité d'afficher un large répertoire de nouveaux domaines de liaison dimère non contraints par la programmation spécifique de la structure des anticorps augmentera notre compréhension des interactions protéine-protéine et mènera potentiellement à la découverte d'activités biologiques uniques.


Un vecteur de présentation sur phage optimisé pour la génération de bibliothèques combinatoires d'anticorps humains et le clonage moléculaire de fragments d'anticorps monoclonaux

Un nouveau vecteur de phagemide, nommé pCM, a été optimisé pour le clonage et l'affichage de bibliothèques de fragments d'anticorps (Fab) à la surface du phage filamenteux. Ce vecteur contient deux longs fragments "de bourrage" d'ADN pour une différenciation plus facile des formes correctement coupées du vecteur. De plus, dans pCM, le fragment au site de clonage de chaîne lourde contient un gène codant pour la phosphatase acide permettant une distinction facile des cellules d'Escherichia coli contenant la forme non modifiée du phagemide par rapport au fragment de chaîne lourde codant l'ADNc. Dans pCM, la transcription de la chaîne lourde Fd/gène III et de la chaîne légère est entraînée par un seul promoteur lacZ. La chaîne légère est dirigée vers le périplasme par le peptide signal ompA, tandis que la protéine Fd/coat III à chaîne lourde est véhiculée par le peptide signal pelB. Le phagemide pCM a été utilisé pour générer une banque d'anticorps de présentation de phages combinatoires humains qui a permis la sélection d'un anticorps de fragment Fab monoclonal dirigé contre la nucléoprotéine (NP) du virus Influenza A.


Matériaux et méthodes

Souches bactériennes, conditions de croissance et phage auxiliaire

E. coli souche TG1 (supE thi-1 (lac-proAB) Δ(mcrB-hsdSM)5 (rK - mK - ) [F' traD36 proAB lacI q Z??M15]) a été utilisé pour construire le vecteur phagémide pDJ01 et la bibliothèque de présentation de phage. E. coli les cellules ont été incubées dans un bouillon tryptone extrait de levure (2xYT) et E. coli transformants en 2xYT avec 20 g ml -1 de chloramphénicol (Cm) à 37°C avec aération. Milieu solide pour la croissance de E. coli les transformants contenaient également 1,5 % (p/v) de gélose. L. rhamnosus la souche HN001 a été obtenue du Fonterra Research Center et a été propagée dans un bouillon Man-Rogosa-Sharpe (MRS) (Oxoid, Basingstoke, Hampshire, Angleterre) à 37°C. Stocks du phage auxiliaire VCSM13d3 avec suppression gIII ont été obtenus par infection de compléments E. coli souche K1976 (TG1 transformé avec le plasmide pJARA112 contenant la pleine longueur gIII sous le contrôle du promoteur inductible par infection phagique psp [49]). Phage auxiliaire VCSM13 (gIII + Stratagene, Cedar Creek, Texas, USA) a été propagée sur la souche TG1.

Isolement de l'ADN chromosomique de L. rhamnosusHN001

Pour la construction de la banque, l'ADN chromosomique a été isolé à partir d'une culture d'une nuit de L. rhamnosus HN001 en utilisant une modification de la méthode décrite précédemment [102]. En bref, une culture d'une nuit a été diluée à 1:100 dans 80 ml de bouillon MRS et incubée pendant une nuit à 37°C. Les cellules ont été récoltées par centrifugation à 5 500 x g pendant 10 minutes, remises en suspension dans 80 ml de bouillon MRS et incubées pendant 2 h supplémentaires à 37°C. Les cellules ont été lavées deux fois dans 16 ml de Tris-HCl 30 mM (pH 8,0), NaCl 50 mM, EDTA 5 mM et remises en suspension dans 2 ml du même tampon contenant 25 % (p/v) de saccharose, 20 mg ml -1 de lysozyme ( Sigma-Aldrich, Castle Hill, New South Wells, Australie) et 20 g ml -1 de mutanolysine (Sigma). La suspension a été incubée pendant 1 h à 37°C. Une lyse supplémentaire des cellules a été accomplie en ajoutant 2 ml d'EDTA 0,25 M, 800 pi de SDS à 20 % (p/v). Après addition de SDS, la suspension a été soigneusement mélangée et incubée à 65°C pendant 15 minutes. Ensuite, la RNase A (Roche, Bâle, Suisse) a été ajoutée à une concentration finale de 100 ug ml -1 et l'incubation a été poursuivie pendant 30 minutes à 37°C. La protéinase K (Roche) a été ajoutée à une concentration finale de 200 ug ml-1 et la suspension a été incubée à 65°C pendant 15 minutes. Enfin, après extractions au phénol et au chloroforme, l'ADN a été précipité par addition de 1/10 de volume d'acétate de sodium 3 M (pH 5,2) et de 2,5 volumes d'éthanol à 95 % (v/v). L'ADN a été sédimenté par centrifugation, lavé avec de l'éthanol à 70 % (v/v), séché à l'air et remis en suspension dans un volume approprié de Tris-HCl 10 mM (pH 8,0).

Construction du nouveau vecteur phagemide pDJ01

Amorces pDJ01F01 (5'-GGCCCGGAAGAGCTGCAGCATGATGAAATTC-3', contenant un OreilleI site (souligné) à l'extrémité 5') et pDJ01R01 (5'-GGGCAATT TCTAGA CCCGGG GCATGCATTGTCCTCTTG-3', contenant, à partir de l'extrémité 5', ÉcoRI (première séquence soulignée), XbaI (première séquence en gras), SmaI (deuxième séquence soulignée) et SphI (seconde séquence en gras) sites de restriction) et la matrice pJARA144 (non publiée) ont été utilisées pour générer un produit PCR contenant le psp promoteur suivi d'un site de liaison ribosomique et d'un site de clonage multiple. Le produit a été clivé avec Oreillemoi et ÉcoRI et ligaturé dans OreilleJE-ÉcoPhagemide pAK100 digéré par RI [73]. La ligature a placé le psp promoteur, le site de liaison ribosomique et le site de clonage multiple directement en amont d'une séquence codant pour le marqueur peptidique C-myc, suivis de suppressible ambre (TAG) codon stop et une séquence codante pour le domaine carboxy-terminal de pIII (Figure 1). Le plasmide a été nommé pDJ01.

Construction du phagemide affichant le SOF de S. pyogenes

Amorces pSOF22F01 (5'-CCGCCGATGCATTGACAAATTGTAAG-3', contenant un NsiI site (souligné)) et pSOF22R01 (5'-CCGCCGCAATTCTCGTTATCAAAGTG-3', contenant un Écosite RI (souligné)) et la matrice, ADN purifié d'un clone λEMBL4 de la sof22 de S. pyogenes souche D734 (sérotype M22 The Rockefeller University Collection), ont été utilisées pour générer un produit PCR codant pour le SOF de la souche M22, incluant la séquence signal mais excluant les séquences de paroi cellulaire et d'ancrage membranaire (963 résidus). Vingt-sept cycles ont été utilisés pour amplifier sof22. Le protocole de thermocyclage a commencé par une étape initiale de dénaturation de 2 minutes à 94°C, suivie de 10 cycles de : une étape de dénaturation (94°C pendant 15 s), une étape d'annelage (59°C pendant 30 s) et une étape d'extension (72°C pendant 2,5 minutes). 17 cycles ultérieurs ont été effectués avec les mêmes étapes de dénaturation et d'hybridation, mais l'étape d'élongation a été prolongée de 2 s à chaque cycle. L'étape d'extension du cycle final a été étendue à sept minutes pour garantir que tous les produits étaient entièrement synthétisés. Le produit de PCR a été clivé avec Nsimoi et ÉcoRI et ligaturé au NsiJE-ÉcoVecteur pDJ01 clivé par RI. Ce phagemide a été nommé pSOF22.

Production et dosages fonctionnels des particules de phagemide affichant le SOF

Les particules de phagemide ont été générées par infection de 100 ml de cultures à croissance exponentielle de TG1(pSOF22) avec des stocks de phages auxiliaires à une multiplicité d'infection de 50 phages par bactérie. Les phages auxiliaires VCSM13 et VCSM13d3 ont été utilisés pour la production de particules de phagémide du pSOF22 (nommés pSOF22 PP/wt et pSOF PP/d3, respectivement) et VCSM13 uniquement pour la production de pDJ01 (contrôle de particules de phagemide négatif nommé pDJ01 PP/wt). Le phage auxiliaire VCSM13d3 n'a pas été utilisé pour la production de particules de phagemide pDJ01 en raison du manque de pIII fonctionnel. Les cellules infectées ont été incubées pendant 4 h à 37°C avec aération. Les cellules hôtes ont été sédimentées par centrifugation et les particules de phagemide ont été recueillies dans le surnageant. Les particules de phagemide ont été purifiées par précipitation dans 5 % (p/v) de PEG, 500 mM de NaCl et remises en suspension dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS 125 mM NaCl, 1,5 mM KH2Bon de commande4, 8 mM Na2HPO4 et 2,5 mM de KCl, pH 7,6). Les particules de phagemide ont été quantifiées sur la base de la quantité d'ADN de phagemide après rupture des virions à 70°C dans 1 % (w/v) de SDS comme décrit précédemment [33].

Le dosage de l'opacité sérique a été réalisé en mélangeant 1 ml de sérum de cheval inactivé par la chaleur avec 10 11 particules de phagémide présentant le SOF (pSOF22 PP/wt pSOF22/d3) ou le contrôle négatif (pDJ01 PP/wt) en présence d'azoture de sodium. Les réactions ont été incubées à 37°C et l'évolution dans le temps de l'augmentation de la densité optique au cours du temps a été surveillée en mesurant la densité optique à une longueur d'onde de 405 nm.

Le dosage de la liaison à la fibronectine a été réalisé par dosage immunoenzymatique sur phage (ELISA [103]). Les puits de microtitrage (Nunc-Immuno MaxySorp™, Roskilde, Danemark) ont été recouverts de fibronectine plasmatique à une concentration finale de 20 µg ml -1, 100 µl par puits dans du PBS (pH 7,2) pendant 1 h à 37°C. Les puits ont été lavés une fois avec 300 µl de PBS, 0,05 % de tampon Tween 20 (PBST) puis bloqués avec 1 % (p/v) d'albumine de sérum bovin (BSA) dans du PBS pendant 2 h à température ambiante. Les puits ont ensuite été lavés (trois fois) avec 300 µl de tampon PBST. Des particules de phagémide (2 x 10 8 ) dans 100 µl de PBS ont été ajoutées aux puits. Les témoins tampons négatifs étaient TE (10 mM Tris, 1 mM, EDTA, pH 8,0), PBS et 0,05 % (p/v) de BSA dans du PBS, et le contrôle négatif des particules de phagémide était pDJ01 PP/wt, généré comme décrit ci-dessus. Les plaques ont été incubées pendant 2 h à température ambiante. Les particules de phagemide non liées ont été éliminées par lavage avec du PBST (sept fois). Pour détecter les particules de phagemide liées, 100 l d'anti-pVIII de souris (anticorps monoclonal contre M13, fd et f1, Progen Biotechnik, Heidelberg, Allemagne) à 0,1 g ml -1 dans 0,1 % (p/v) de BSA/PBS ont été ajoutés et incubés pendant 1h à température ambiante. Les puits ont ensuite été lavés avec 300 l de tampon PBST (cinq fois) et 100 l d'anticorps secondaire anti-souris conjugué à HRP ont été ajoutés à une dilution de 1:2000 et incubés pendant 1 h à température ambiante. La plaque a été lavée sept fois avec du tampon PBST et développée en utilisant le kit de substrat ImmunoPure TMB (Pierce, Rockford, Illinois, USA). L'absorbance a été lue à 450 nm. Les particules de phagemide ont été quantifiées comme décrit ci-dessus.

Construction de la bibliothèque complète du génome

La bibliothèque a été construite à partir de cisaillement mécanique (nébulisation) L. rhamnosus HN001 et cloné dans le vecteur phagémide pDJ01. Un nébuliseur médical jetable contenant 1,5 ml d'ADN chromosomique tamponné (environ 20 g) et 25 % (v/v) de glycérol a été soumis à de l'azote gazeux à une pression de 10 psi pendant 90 s. Les fragments obtenus variaient en taille entre 0,3 et 4 kb, la majorité entre 0,5 et 1,6 kb. Des extrémités franches ont été obtenues par traitement avec de l'ADN polymérase T4 (Roche), un fragment de Klenow de l'ADN polymérase I (Roche) et OptiKinase™ (USB Corporation, Cleveland, Ohio, USA). Pour éliminer les fragments inférieurs à 0,3 kb, la résine d'exclusion stérique Sepharose CL-4B 200 (Sigma) a été utilisée. Le vecteur phagémide pDJ01 a été digéré par l'enzyme de restriction SmaI (Roche) et déphosphorylée avec de la phosphatase alcaline de crevette (Roche). Les manipulations d'ADN ont été réalisées selon les méthodes standards [104].

Environ 10 µg des fragments génomiques ont été ligaturés à 3 µg du vecteur pDJ01 en utilisant la T4 ligase (Roche). Après extraction au phénol et au chloroforme, l'ADN ligaturé a été précipité à l'éthanol, lavé avec de l'éthanol à 70 % (v/v) et dissous dans 25 l d'H.2O. Le mélange de ligature a été transformé en E. coli TG1 par électroporation (2,5 kV, 25 F, 400 Ω) dans des cuvettes à espacement de 2 mm. Les cellules transformées ont été transférées dans 50 ml de 2xYT et incubées pendant 1 h à 37°C avec agitation rotative. Après l'incubation, une aliquote de 2 ml a été prélevée pour déterminer le nombre de transformants en étalant sur de la gélose 2xYT avec 20 g ml -1 de chloramphénicol. Les bactéries restantes ont été amplifiées pendant une nuit à 37°C avec aération.

Sélection directe de la bibliothèque de présentation sur phage du sécrétome

Une aliquote de 1 ml de la culture d'une nuit contenant toute la banque de génomes a été utilisée pour ensemencer 25 ml de 2xYT-Cm. La culture en croissance exponentielle (OD600 environ 0,2) a été infecté par le phage auxiliaire VCSM13d3 (multiplicité d'infection = 50) pendant 1 h. Les cellules ont ensuite été récoltées par centrifugation à 3 200 × g pendant 10 minutes, le culot a été remis en suspension dans 1 ml de 2xYT, mélangé avec 10 ml de gélose molle (bouillon 2xYT avec 0,5% (p/v) d'agarose) et versé sur quatre 2xYT-Cm plaques. Tant la gélose molle que les plaques contenaient de l'agarose de qualité biologie moléculaire au lieu de la gélose bactériologique. Les plaques ont été incubées pendant une nuit à 37°C, puis les particules de phagemides ont été extraites des plaques en ajoutant 5 ml de 2xYT sur chaque plaque suivi d'une agitation rotative lente à température ambiante pendant 4 h. Les particules de phagemide extraites ont été précipitées par 5 % (p/v) de PEG, 0,5 M de NaCl et remises en suspension dans du tampon TN (10 mM de Tris, 150 mM de NaCl, pH 7,6). Pour éliminer les particules de phagémide instables (défectueuses), le précipité a été traité avec du sarcosyl à une concentration finale de 0,1 % (p/v). L'ADNsb libéré des particules de phagemide défectueux a été éliminé par la DNase I (100 g ml -1 ) en présence de 5 mM de MgCl2. La DNase I a ensuite été inactivée par EDTA (20 mM). L'ADNsb a ensuite été extrait des virions résistants au sarcosyle. Tout d'abord, l'ADNsb a été libéré des particules de phagemide par incubation à 70°C pendant 10 minutes en présence de 1,2 % (p/v) de SDS. Une purification supplémentaire de l'ADNsb a été réalisée en utilisant un mini kit de préparation de plasmide (Roche). Pour amplifier la banque de sécrétomes à partir de l'origine plasmidique de réplication, E. coli la souche TG1 a été transformée avec de l'ADNsb purifié.

Analyse de séquence de sélectionné L. rhamnosusClone HN001

Après transformation, 491 clones ont été sélectionnés au hasard pour analyse. L'ADN de phagemide de ces clones a été purifié à l'aide du kit 96-easy Mini-prep (V-Gene Biotechnology, Hangzhou City, Chine). Les inserts ont été séquencés à l'aide de l'amorce pDJ01R02 (5'-CCGGAAACGTCACCAATGAA) et du kit de séquençage de cycle BigDye ® Terminator v3.1 (Applied Biosystems, Foster City, Californie, États-Unis) et ont été analysés sur un analyseur génétique ABI3730 (Applied Biosystems) chez AWC Genome Services (Université Massey). Tous les inserts ont été séquencés à partir de l'extrémité 3', puisque notre intérêt s'est porté sur les ORF en fusion avec gIII. Le séquençage et l'analyse des séquences ont été effectués par lots de 96 clones. Après l'analyse des séquences des 192 premiers clones, les clones dont les séquences ont été détectées plus de cinq fois ont été exclus d'un séquençage ultérieur en utilisant l'hybridation dot blot. Les séquences obtenues ont été analysées avec le logiciel Vector NTI (Invitrogen, Carlsbad, Californie, USA) et GLIMMER version 3.02 en utilisant un ensemble d'apprentissage généré contre le L. rhamnosus HN001 ébauche de séquence du génome, une matrice de pondération de position représentant les sites de liaison du ribosome pour les gènes HN001 et une approche itérative, telle que décrite dans la documentation du logiciel, pour prédire les ORF [105]. Si l'extrémité 5' de l'ORF n'était pas atteinte, une réaction de séquençage utilisant l'amorce complémentaire vecteur sens pDJF03 (5'-ATGTTGCTGTTGATTCTTCA-3') a été réalisée.

SignalP 3.0 [106] et TMHMM 2.0 [107] ont été utilisés pour la prédiction de la séquence signal et des hélices transmembranaires, respectivement, en utilisant les paramètres par défaut (pour les bactéries Gram-positives) et les valeurs seuils [14, 50]. Les hélices transmembranaires situées à l'extrémité amino qui, dans l'analyse SignalP 3.0, ont montré un score pour le site de clivage de la peptidase signal (score C) inférieur à 0,52 ont été considérées comme des ancres membranaires amino-terminales. La présence d'une hélice transmembranaire a été confirmée en utilisant le programme de prédiction TMHMM [108]. Les séquences signal des lipoprotéines ont été prédites par le serveur LipPred [109] en utilisant les paramètres par défaut et les valeurs seuils [53]. TATFIND 1.4 a été utilisé pour la prédiction des séquences signal Tat [110].

Toutes les séquences d'insertion traduites ont été examinées avec BlastP [111] sur le site Web du NCBI [112] avec des paramètres par défaut pour identifier les similitudes avec d'autres protéines bactériennes. Une valeur e inférieure à e -10 a été utilisée comme seuil pour une similitude notable. De plus, les domaines conservés ont été identifiés dans nos séquences de requête par le moteur Conserved Domain Architecture Retrieval Tool (CDART) au cours de la recherche, les domaines connus étant dérivés soit de clusters de groupes de protéines orthologues (COG) [113], soit de Pfam [114 ] bases de données.


Phagemide

Phagemide
Plasmide qui contient une partie d'un génome de phage. Lors de la co-infection de l'hôte avec un phage auxiliaire, le plasmide peut être emballé dans des particules de phage. Un type de phagemide est conditionné sous forme d'ADNsb dans des particules de phage M13.

Phagemide: Un type de plasmide qui porte dans sa séquence une origine de réplication de bactériophage. Lorsque la bactérie hôte est infectée par un phage « auxiliaire », le phagemide est répliqué avec l'ADN du phage et emballé dans les capsides du phage.
.

[12] Le fragment d'ADN à muter est inséré dans un phagemide telle que M13mp18/19 et est ensuite transformée en une souche d'E. coli déficiente en deux enzymes, la dUTPase (dut) et l'uracile déglycosidase (ung).

vecteur de clonage - construction d'ADN artificiel intentionnellement conçue utilisée par les biologistes moléculaires pour amplifier des morceaux sélectionnés d'ADN insérés dans la construction, les exemples incluent plasmide, phage,

&phage lambda - Lysogène
Phage T4 (169 à 170 kpb, 200 nm de long)
Phage T7
Phage R17
Phage M13 -


Vecteurs de phagemides

Notre partenaire Antibody Design Labs propose un large choix de vecteurs de phage et de phagemide pour relever le défi de la présentation sur phage. La sélection des liants est un processus complexe dépendant de plusieurs variables et conditions expérimentales, ce qui fait du temps et des ressources les principaux facteurs limitants du succès des biopannings.

Nous proposons actuellement des options variées pour l'affichage du côté N-terminal de la protéine du gène III de pleine longueur avec le peptide leader PelB en utilisant un système phagemide ou des vecteurs phagiques.


Les vecteurs phagiques (voir lien ci-dessous) produisent un affichage multivalent et conviennent mieux aux peptides et scFv.

Les phagemides sont les mieux adaptés à la présentation d'anticorps tels que les fragments scFv et Fab mais peuvent également être utilisés pour présenter des peptides à faible valence.

pADL™-100 Affichage maximal du vecteur phagemide :


Applications:
• Phage display du côté N-terminal de la protéine du gène III du bactériophage filamenteux
• Affichage polypeptidique
• Bibliothèques de peptides d'affichage sur phage


pADL™-20c / 22c / 23c Série de vecteurs de phagemides à affichage élevé :


Applications:
• Phage display du côté N-terminal de la protéine du gène III du bactériophage filamenteux
• affichage scFv et Fab
• Expression scFv ou Fab gratuite

pADL™-10 Vecteur de phagemide à faible affichage :


Applications:
• Phage display du côté N-terminal de la protéine du gène III du bactériophage filamenteux
• affichage scFv Liens connexes


Affichage phagemide - Biologie

Un examen complet de la technologie d'affichage sur phage pour la production d'anticorps monoclonaux recombinants.

Les anticorps monoclonaux ont contribué de manière significative dans divers domaines, tels que la biologie moléculaire, la recherche pharmaceutique et médicale, et ont également contribué au traitement de maladies telles que le cancer et les maladies infectieuses [1-3]. Les anticorps recombinants (rAb) sont apparus comme un moyen précieux et pratique pour la recherche, le diagnostic de diverses maladies et comme l'une des classes de protéines thérapeutiques à la croissance la plus rapide. Divers systèmes de production rapide et à grande échelle d'anticorps recombinants ont été utilisés pour répondre à la demande croissante d'anticorps. The benefit of huge amount and consistent quality of the in vitro antibody production methods have interested researchers to make improvements and try various production systems, viz. Gram-negative and Gram-positive bacteria, yeast (for example Adimab platform [4] ) and filamentous fungi, insect / mammalian cell lines, or more recently in transgenic plants and animals [5-7] for economic and large-scale production of rAbs. The other advantages offered by the rAbs include improvements in intrinsic properties such as immunogenicity, affinity, specificity, and stability of antibodies by a variety of mutagenesis techniques [8-10]. Libraries of antibody gene fragments can be cloned into expression vectors and displayed as a single-chain variable fragment or Fab-fragment antibodies on the surface of filamentous bacteriophage [11]. This technique, known as phage display, has helped enormously to study molecular biology mechanisms involving protein-protein [12] or protein-nonprotein interactions [13]. There are many excellent and comprehensive reviews on this topic, and one of the most recent ones is by the Bio-Rad group [14]. Phage display with pre-selected antibodies has also been exploited to enable barcoding of antibodies and thus highly multiplexed and quantitative cell-surface protein profiling [15]. Phage display can also be used to identify other types of protein affinity reagents such as Ras-binding domains [16].

The technique was initially demonstrated by George P. Smith in 1985 [17]. McCafferty and colleagues, in 1990, confirmed its use for the production of recombinant antibodies with desired specificities [18]. Since then, many research groups have contributed towards essential improvements and modifications of the technique for its potential applications in basic and applied biological sciences. Phage display technology allows the isolation of human antibodies against almost any antigen through the clonal selection of antibody fragments in a prokaryotic system, thus facilitating both immunotherapy and in vivo diagnosis. The range of antibodies from antibody libraries is limited by the initial calculated complexity of the antibody fragment gene library. Because the antigen-binding fragment is a heterodimer, the library complexity is increased by the random combination of heavy- and light-chain sub-libraries.

As previously mentioned, phage display technology refers to the use of phages for display of random peptides, foreign proteins or protein domains, as fusion proteins, on their surface [19]. Phages are viruses which infect bacterial cells. Mostly, the vectors used in recombinant DNA technology, are bacteriophages which infect Escherichia coli, the standard recombinant DNA host. An essential feature of such recombinant DNA vectors is that they can contain stretches of foreign DNA, which gets expressed in the host cell when the vector replicates. A phagemid vector, termed so for its phage origin genome, provides such features and enables expression of the foreign DNA, purposely introduced in the vector in such a way that it is expressed in conjunction with a phage protein, as a fusion protein, for display on the phage surface [19]. A variety of bacteriophages, viz. Ff filamentous phage, Lambda and T7 [20, 21] have been utilized in phage display with the most common being the Ff phage family (e.g., M13, fd-phage). These have been preferred, amounting to their potential as excellent cloning vehicles and simplicity for correct assembly of longer phage particles [21]. The PIII or PVIII surface proteins of the phage are used for display of recombinant peptides. Several options aid in avoiding the limitations of the conventional display system [22]. M13 filamentous phage-based libraries like Ph.D.TM-7, Ph.D.TM-12, Ph.D.TMC7C from New England Biolabs, or spherical T7 phage, T7Select® from Merck are available.

The most productive phage in nature is the filamentous phage which infects Escherichia coli. It generates titers of up to 10 13 per ml of bacterial culture. These bacteriophages infect a range of Gram-negative bacteria using the bacterial pili as a receptor. The best characterized of these phages (M13, fl, and fd) are collectively referred to as the Ff phage. These infect E.coli containing the F conjugative plasmid. The first phage display libraries of peptides and antibodies were published in 1990-1991 [23-26], after which the technique underwent numerous improvements for its varied applications.

The vectors designed by combining portions of plasmid and phage genome, for cloning and expression of fusion proteins are known as phagemid vectors. These vectors enclose an M13 phage origin of replication and packaging signal along with an origin of replication and the expression system of the plasmid. Usually, the expression plasmids are composed of multiple cloning sites, an antibiotic resistance marker, epitope tags such as a hexahistidine tag or a c-myc tag [27], and a lacZ promoter [28]. The phagemids habitually contain a gene sequence which codes for coat protein which will be fused to the foreign DNA that is to be expressed [23, 29], and a stop codon (usually amber), to permit host specific expression of the pIII fusion protein or a soluble fusion partner [30]. Phagemids can uphold themselves as plasmids, allowing the expression of the desired protein in the bacterial cell, but they do not have the other genes necessary for phage assembly. Therefore, infection of the phagemid-transformed host cells, with a helper phage becomes essential for the production of viable phage particles. The helper phage is the bacteriophage itself, which is engineered to provide the proteins essential for phage assembly. The phage-foreign fusion proteins can be displayed as either N-terminal fusions with pIII, pVII, pVIII, or pIX, for large proteins [31, 32] or C-terminal fusions with pIII, pVI, or pVIII proteins of the phage [33, 34]. The phage particles can be used in binding selections, and the binding clones can be multiplied through infection of E. coli host.

A drawback of the phagemid system is the reduction in the number of recombinant fusion proteins displayed on each phage particle due to competition between the wild-type coat protein and a fusion coat protein for integration into the phage particle [11]. Because of this problem, a modified helper phage, known as the hyperphage, was designed [35] which reportedly enhanced the yields of recombinant phages displaying the recombinant antibodies by more than two orders of magnitude. Hyperphages have a wild-type pIII phenotype and are therefore able to infect F+ E. coli cells with high efficiency however, they lack a functional pIII gene which renders these particles non-functional and thus require the phagemid-encoded pIII–antibody fusion for complete phage assembly (Figure 1). The outcome is a significant rise in the proportion of recombinant antibody displaying phages. It was reported that the antigen-binding activity also got affected by the use of the hyperphage. As a result, the hyperphage was found to be valuable in cases of selecting antibodies against rare epitopes.

Apart from this, specific mutations were also introduced in the coat proteins for the development of a hybrid phage display system [27], in which, two copies of the gene encoding coat protein exist: one with the scFv fusion and the other coding the natural non-fusion protein. Finally, the amount of recombinant proteins displayed is determined by more than a few factors, viz., type of coat protein chosen for fusion (pIII or pVIII), display system chosen for expression (phage or phagemid), and the choice of helper phage in case a phagemid system is used.

Some of the most widely used and commercially available phage display vector systems include, pSEX81 [36, 37], pCANTAB 5E [38-40], pCOMB3 [41] or its derivates, for example, pComb3XSS (Addgene 63890) [42, 43].

The phagemid vector, pSEX81, has been engineered for expression of functional single-chain Fv antibody-pIII fusion proteins on the surface of M13 bacteriophages. The phagemid was constructed explicitly for cloning of immunoglobulin heavy and light chain gene fragments isolated from human or mouse antibody libraries. The cassette vector, pSEX81, was designed for the convenient insertion of heavy and light chain variable domain coding regions and the production of a functional single chain of M13 bacteriophages. The corresponding DNA fragments of human or mouse origin can be amplified by PCR using the degenerate IgG/IgM, or IgG primer sets respectively, available from the same company. The amplified gene fragments encoding variable heavy or light domain are cloned in-frame between a signal peptide sequence of bacterial pectate lyase (pelB) for secretion of the fusion protein into periplasmic space and pIII gene of M13 bacteriophage.

The VH and VL genes are joined by a DNA fragment coding for a flexible 18 amino acid residue linker containing first six amino acids of CH1 constant region domain and the hydrophilic pig brain alpha tubulin peptide sequence "EEGEFSEAR". Vector backbone further provides a strong promoter, the T7 terminator, ColE1 origin of replication, intergenic region of phage F1 and an ampicillin resistance marker for selection. In pSEX81 the recognition sites of restriction endonucleases Nco I and Hind III allow insertion of VH gene fragments. For the insertion of a VL gene fragment, sites of restriction endonucleases Mlu I and Not I are present.

The systems for phage display can be categorized along the lines of the arrangement of the phage genes coding for coat proteins [44, 45]. A ‘type 3’ vector, consists of a single phage chromosome (genome) containing a single gene III for expression of foreign DNA and a single type of pIII protein molecule. In theory, the foreign peptide encoded by the insert gets displayed on all the five pIII molecules on a virion (though practically the host proteolytic enzymes remove the foreign peptide from some or even most of the pIII copies, especially if the foreign peptide is large). Likewise, the ‘type 8’ and ‘type 6’ vectors display foreign peptides on every copy of pVIII and pVI, respectively [46-48]. In a ‘type 88’ vector, the phage genome bears two VIII genes, which encodes for two different types of pVIII molecules, a recombinant one, bearing the foreign DNA and the wild-type one. This system allows the display of larger proteins on the phage surface. In the same way, the ‘type 33’ vector bears two genes III. A ‘type 8+8’ system is different in the manner that the two VIII genes are on separate genomes. The wild-type being on a phage (helper phage), while the recombinant one on the phagemid [28, 49]. The ‘type 3+3’ and the ‘type 6+6’ systems are reminiscent of ‘type 8+8’ systems.

Production of large quantities of antibodies becomes challenging due to the high complexity of the immunoglobulin molecules. The immunoglobulin G is a heterotetramer, consisting of two different polypeptide chains joined by the inter-chain disulfide bonds. The antibody light chain and heavy chain consist of several domains known as “immunoglobulin folds”, each of which requires intra-domains disulfide bond for stabilization. An oxidizing environment along with the complex apparatus is much needed for efficient and correct conformation of a large number of disulfide bonds together with folding and assembly of four chains to one IgG molecule. The in vitro hosts for the production or selection of antibodies, generally have less optimal conditions for expression of a correct and complete immunoglobulin molecule. Thus, many researchers opted for other smaller sized formats of antibodies, which retained the antigen-specificity and also provided significant advantages.

By far, the ‘Fv’ fragment is the smallest antigen-binding fragment of immunoglobulin retaining complete antigen binding site and consists of only the variable fragments of an antibody structure. A single-chain variable fragment (scFv) is a fusion protein of the variable regions of the heavy (VH) and light chains (VL) of immunoglobulins (Figure 2), connected with a short linker peptide often to about 25 amino acids, which helps to improve the stability of the short antibody. The flexibility and solubility of the linker are due to the glycine and serine or threonine amino acid residues, respectively. The linker can either connect the N-terminus of the VH with the C-terminus of the VL or vice versa. This protein retains the specificity of the original immunoglobulin, despite the removal of the constant regions and the introduction of the linker. These molecules were created to facilitate phage display, where it is highly convenient to express the antigen-binding domain as a single peptide. As an alternative, scFv can be constructed directly from a sub-cloned heavy and light chains derived from a hybridoma. Since the scFvs are only half the size of a Fab fragment and still retain the original specificity of the parent immunoglobulin, they have significant applications in techniques, such as flow cytometry, immune-histochemistry, and as antigen-binding domains of artificial T cell receptors, etc. Unlike monoclonal antibodies, which are often produced in mammalian cell cultures, scFvs are more often produced in bacteria cell cultures such as E. coli, allowing an easy and faster production of antibodies in massive amounts.

The fragment antigen-binding (Fab fragment) is the antigen-binding region on an antibody, which is composed of a constant and a variable domain. The domains form the paratope — the antigen-binding site — at the amino-terminal portion of the monomer. The two variable domains facilitate binding with specific antigens. For example, Tao Y et al selected for Fabs against Wnt receptors from a phage-displayed synthetic library F [50]. Slezak T et al developed a modular antibody platform based on the phage display of Fab fragments [51].

A diabody comprises two scFvs which are connected with linker peptides, too short for the two variable regions to fold together (about five amino acids), forcing dimerization of the scFvs. Diabodies have a much higher affinity to their target, due to much lower dissociation constants.

Another recombinant antibody format, called as scFv-zipper, consists of two scFv antibodies, with same or different antigen specificities, linked with leucine zippers.

Thus, the phage-displayed recombinant antibodies (rAbs), which provide a direct link between the genotype and phenotype of the antibody to be displayed [52], have been displayed as functional binding molecules in different formats of antibody fragments [18, 30]. At present, the most widely used and applicable formats are scFv and Fab fragments, particularly expressed in eukaryotes.

Various types of libraries have been utilized for selection of specific antibodies: (1) antigen- or pathogen-specific library sourced from immunized animals, for example, leukocytes from an immunized llama [42, 53], (2) a single-pot or universal library without any specificity, (3) mutant libraries generated from mutated DNA sequences of a monoclonal hybridoma line or single phage clone [54, 55]. The single-pot universal libraries are extremely assorted and allow the selection of antibody fragments with binding affinities to a wide range of antigens [21] due to the size of their repertoire [56].

Polymerase chain reaction (PCR) has enormously simplified the cloning of variable region genes. The cDNA synthesized from mRNA isolated from B-lymphocyte population is used as a template for PCR- based amplification of VL and VH immunoglobulin genes. The mRNA can also be isolated from hybridoma cell lines, single clones obtained from the primary library. PCR amplification requires oligonucleotide primers complementary to the antibody gene sequences. Degenerate primer sets have been used to amplify almost all the possible sequences for the variable light or variable heavy chain genes for the generation of a library. Many of the primer sets have been reported with various target sequences for primer annealing [57-60].

A set of downstream primers analogous to sequences encoding parts of CH1 and CL chains have been used for amplification of the variable genes from antibodies of different subclasses. Assembly of the two variable domains into a single gene can be made possible by a DNA linker either in the VH-linker-VL format or the VL-linker-VH type [61, 62]. It has been noted that the expression level of scFv in N-termini-VL domain-linker-VH domain C-termini orientation was relatively high in comparison to the other format. Hence, to obtain high yields of the antibodies, insertion of the gene sequence coding for them should be in the desired frame in the phagemid vector. The most significant advantage offered by phagemid vectors is their small size (3–5 kb) and high efficiency for transformation in bacterial cells. In general, the recombinant phagemid is introduced into competent E. coli, followed by infection of the bacterial host cells with a helper phage (M13VCS or K07) to yield a recombinant phage that displays antibody fragments as fusions to one of the phage coat proteins.

Solemani Zadeh et al published a detailed protocol for efficient construction and screening of synthetic domain phage variable libraries (with 50-fold improvement of elution efficiency) [63]. Ferrara F et al combined phage and yeast display to identify monoclonal antibodies with desired binding properties [64].

Phage display based in vitro affinity selection of antibodies resembles the clonal selection of antibodies in vivo [65]. The target antigen is immobilized on surfaces based on the choice of the researcher, and the library is applied onto it, enabling affinity-based selection of highly reactive antibodies. The non-specific phage particles get eliminated during washing steps, and those which remain bound to the immobilized antigen, are eluted by addition of appropriate elution reagents. The antigen-specific phages can then be amplified in a proper strain of E. coli for their downstream applications or the next selection cycle facilitating further enrichment. This affinity selection process is known as bio-panning, and the final round of it can be determined by assessment of no more additional rise in the yield of eluted phages [65].

Bio-panning includes recurring rounds of phage binding to the target, washing to remove non-binding phage and elution steps to get binding phage and re-amplification of the phage pool enriched for specific binding phage. Any other methods which help in separation of specific from non-binding clones can be employed as selection methods. Most commonly in vitro selection method, such as bio-panning on immobilized antigen coated onto paramagnetic beads [66], plastic tubes or Petri dishes [54], columns with an antigen-activated matrix [18], or specifically coated BIAcore sensor chips [56], selection using biotinylated antigen [55] or direct selection on fixed prokaryotic cells respectively mammalian cells [67] have been reported.

A large fraction of non-specific phages get washed, and the phage clones bearing antibodies with specific binding properties to the matrix are eluted by using appropriate elution reagents. The fact that the M13 phage is stable at extremes of temperature and pH has been utilized successfully in experimenting with the choice of elution reagents. Acidic solutions, like HCl, glycine buffers [56, 68], basic solutions, like triethylamine [54], or even reducing agents have been used. In other cases, a competition elution by an excess concentration of antigen [24] or antibodies to the antigen has also been reported. Another gentle strategy has been the use of enzymes for cleavage of a protease site engineered between the antibody and pIII protein of the phage [21].

An in vivo selection involves the introduction of phage particles directly into animals of choice followed by the collection of target tissues. Such a method has helped in the research studies on cellular receptors and identification of peptides or antibodies with specificity for them [69, 70]. For a further selection of monoclonal antibodies, the phage clones obtained after final round are propagated individually and characterized for desired binding specificities [21].

Alfaleh et al, for example, used cell-based biopanning to isolate anti-CD117 antibodies, which were evaluated by flow cytometry and immunohistochemistry [71]. Kim et al panned a Fab phage display library against the spike protein of Middle East respiratory syndrome-coronavirus and generated highly specific Fab fragments and monoclonal antibodies, with the potential as diagnostic agents [72]. D Wrapp et al developed a VHH phage library against the S proteins of MERS-CoV and SARS-CoV-1 viruses using the pMECS vector [73].

The antibodies generated through recombinant methods hold superiority than the hybridoma produced [74], as the former can be improved for its qualities and modified as per the desired applications. Affinity maturation of rAbs has been reported [24, 75]. High-affinity antibodies against a broad spectrum of antigens have been derived from various immunized animals, such as llamas [53, 76], mice [77], chickens [78], rabbits [79], and also from sheep [80] and nonhuman primates [75].

Very high volumetric yields have been reported for cytoplasmic expression of rAbs in E. coli. Production of smaller antibody fragments has been reported up to grams per liter amounts in bacteria [81]. Expression of a functional rAb in E. coli was first reported by Skerra and Plückthun in 1988 [82], where both V chains were translocated into the periplasmic space of the bacterial cells. The oxidizing environment in the compartment allowed correct conformation of the functional Fv fragment by the formation of appropriate disulfide bonds. The approach was also utilized for the expression of first time functional Fab fragments in E. coli [83]. The expression of recombinant antibodies in reducing cytoplasm more often than not results in non-functional aggregates [84].

On the other hand, expression of functional antibody fragments in cytoplasm most of the times requires complete denaturation and refolding [85]. However, successful production of functional scFvs in the cytoplasm of E. coli, not requiring refolding has also been reported [86-88]. The type of host strain and the specificity of the antibodies are known to affect the expression of functional rAbs in E. coli. A good number of rAbs have been produced in the periplasm of E. coli using N-terminal leader sequences targeting the periplasmic Sec pathway [89-91]. Following the expression of the rAbs, the molecules are isolated from the periplasmic fraction [92, 93], or culture supernatants [94, 95]. The expression, periplasmic transport, accurate folding and assembly of two different polypeptide chains is highly necessary for the expression of rAbs in the Fab format. The bi-cistronic vectors with the first cistron encoding the light chain and the second cistron encoding the Fd fragment (consisting of VH and CH1) were found to be optimal for such requirements [92]. Production of a full size glycosylated IgG in E. coli has also been reported [96], only after the fine-tuning of the translation strength of both IgG chains, by the introduction of silent mutations into the translation initiation region of the leader sequence which facilitated optimal periplasmic transport [96].

  • Origin, diversity, and parallel selection: A variety of sources can be used for generation of large diversity antibody libraries. High diversity allows the selection of antibodies against multiple targets simultaneously, thereby saving considerable time, efforts and costs associated with monoclonal antibody (mAb) generation.
  • Ease of development: The time required for construction of libraries, the selection of mAbs with desired specificities, and optimization of assays based on mAbs are much less than the conventional fusion methods.
  • Specificity/ affinity: Direct relation of the genotype to the phenotype of the developed antibody.
  • Formats: Different variants can be generated depending upon the downstream applications of mAbs.
  • Scope of improvement: Molecular methods allow the scope of perfection for the mAbs either before or after development. Affinity maturation strengthens the binding efficacy of antibodies to the target antigen, providing mAbs a higher affinity, and specificity towards the target. The recombinant mAbs can be conjugated to reporter enzymes for direct detection.
  • Stability: The phage display libraries are very stable, even for an indefinite period, and can be revived after long-term storage, by infection of bacterial cells.
  • Concentration: The large diversity libraries often contain displayed antibodies at low molarities.
  • Library complexity: The number of antibody display clones is less than the recombinants, which may at times interfere with the selection of mAbs directed towards rare targets.
  • Selection bias: Biological selection is reported to be biased against cysteine residues in odd numbers, positive charged or specific residues at fixed positions. Further, the selection is limited to the interaction of target antigen and the antibody.
  • Biological efficacy: The application of monoclonal antibodies is limited for use as therapeutics in organisms different than their origin.

Hence, high yield expression of rAbs in E. coli can be achieved only after addressing various issues like host toxicity, vector mutation, and plasmid loss. Such decisive constraints can be addressed by the promoter system, plasmid copy number, etc. [97]. One modification is the growth of bacterial cells between the temperature range 20 to 30°C rather than at 37°C to steer clear of the overloading of E. coli’s secretory pathway. Nevertheless, very high yields of antibody fragments in E. coli can be facilitated by high cell density fermentation in bioreactors. Cell-wall-less L-forms of the Gram-negative bacterium Proteus mirabilis have also been experimented for the production of miniAbs and scFvs [98, 99], to obtain high yields of functional scFvs [99].

The expression of recombinant antibody fragments (scFv, Fab) has been reported in numerous microorganisms, especially in selected strains of E. coli. The choice for E. coli host strains such as BL21 and their derivatives amounts to the fact that the antibodies can be produced economically in bulk amounts. The soluble antibody fragments can be expressed in the culture supernatant, bacterial periplasm, and/or inside the bacterial cytoplasm [100-102]. Though the secretion of the rAbs in the periplasm and the media provide a less overall yield, the oxidative environment outside the cell cytoplasm confers proper formation of disulfide bonds required for natural folding of antibody domains.

Antibodies expressed into the periplasmic space are extracted by osmotic shock. RAbs expressed in considerable amounts in the cell cytoplasm frequently results in extensive aggregation and formation of inclusion bodies, which can be purified from the other cellular components. The aggregated antibody mass can be made soluble by adding strong denaturants for instance urea or guanidium hydrochloride including some oxido-reduction system. The native antibody fragments are recovered by refolding upon removal of the denaturants. Guidelines for antibody refolding have been extensively reviewed [103].

Apart from E. coli host cells, the rAbs have been expressed in mammalian systems [104, 105], insect cells [106, 107], yeasts like Saccharomyces cerevisiae [108], Schizosaccharomyces pombe [109], Hansenula polymorpha [110], and also in Pichia pastoris [111] and in bacterial host strains such as Bacillus brevis [112]. Generally, the choice of expression hosts (bacteria, yeast, plants, insect or mammalian cells) must be reliable as per the final application of the antibody molecule.


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