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Étymologie de vimentine

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Quelle est l'étymologie du filament intermédiaire, Vimentin ?


D'après ce papier :

Du mot latin vimentum, utilisé pour décrire des ensembles de tiges flexibles, à la fois ordonnées (par exemple, les latex, les filigranes et l'osier) et non ordonnées (par exemple, les broussailles).

Vimentin :

Art en filigrane :


Vimentin

Vimentin

La vimentine, également connue sous le nom de filament intermédiaire de fibroblaste, est le principal filament intermédiaire trouvé dans les cellules non musculaires ( Colvin et al., 1995). Ces types de cellules comprennent les fibroblastes, les cellules endothéliales, les macrophages, les mélanocytes, les cellules de Schwann et les lymphocytes. Ceci contraste avec la kératine, qui est le filament intermédiaire trouvé dans les cellules épithéliales. La vimentine est composée d'une seule sous-unité et a un poids moléculaire d'environ 57 kD. In vivo, la vimentine n'est généralement pas présente dans les cellules épithéliales normales, cependant, elle a été cultivée in vitro dans les cellules épithéliales et peut également montrer une expression dans les cellules tumorales d'origine épithéliale, généralement dans le tissu de paraffine après la récupération de l'antigène. Les cellules mésenchymateuses et endothéliales sont généralement colorées positivement pour la vimentine et agissent ainsi comme une mesure de contrôle de qualité interne de l'immunoréactivité. L'absence d'immunocoloration dans ces zones indique souvent qu'il y a des dommages importants aux antigènes tissulaires et une perte de l'architecture structurelle.

L'épithélium bénin de la surface de l'ovaire normal est une couche unique de cellules épithéliales d'origine mésodermique spécialisée tapissant l'ovaire. Il est très complexe et semble présenter des caractéristiques typiques des cellules mésenchymateuses à la fois in vivo et lorsqu'il est cultivé en culture. Ces cellules expriment souvent la vimentine, et jusqu'à 40 % des cas de cancer de l'ovaire sont positifs à la vimentine. Cependant, il n'y a pas de corrélation clinique entre la coloration à la vimentine et le degré de différenciation tumorale ou la présence d'une maladie ganglionnaire. L'utilisation de la vimentine est considérablement limitée par son manque de spécificité, qui est le résultat de sa large distribution dans une variété de types cellulaires au début de la vie embryonnaire avant qu'ils ne soient remplacés par des filaments intermédiaires plus spécifiques plus tard dans le développement.

En utilisant des méthodes immunologiques, la vimentine peut être facilement démontrée dans des coupes congelées ainsi que des coupes en paraffine. Cependant, dans les tissus fixés au formol, la coloration de la vimentine peut être réduite et les résultats peuvent être incohérents. Une partie de cette expression incohérente peut être réduite en utilisant des méthodes de récupération d'antigène. En général, les CO primitifs sont plus fréquemment vimentine positifs par rapport à l'adénocarcinome pulmonaire primitif. Par conséquent, l'absence de coloration à la vimentine dans ce cas aurait tendance à favoriser un carcinome primaire du poumon par rapport à un carcinome primaire de l'ovaire.


Biologie cellulaire du glioblastome multiforme : de la science fondamentale au diagnostic et au traitement

Décrit pour la première fois dans les années 1800, le glioblastome multiforme (GBM), un néoplasme de classe IV avec différenciation astrocytaire, selon la classification révisée 2016 de l'Organisation mondiale de la santé des tumeurs du système nerveux central (SNC) est la tumeur maligne la plus courante du SNC. Le GBM présente un ensemble extrêmement large d'altérations, à la fois génétiques et épigénétiques, qui produisent un grand nombre de sous-groupes de mutations, dont certains ont un rôle établi dans la survie indépendante des patients et la réponse au traitement. Tous ces composants représentent non seulement un cycle fermé, mais sont également pertinents pour le comportement biologique de la tumeur et la résistance au traitement car ils forment le comportement pathobiologique et l'évolution clinique. La présence de différentes mutations déclenchantes sur le fond de la présence de mutations clés dans les cellules souches GBM (GBMsc) sépare en outre le GBM en tant que primaire résultant de novo des précurseurs de cellules souches neurales se développant en GBMsc et secondaires, au moyen de mutations agrégées. Certains des changements dans la biologie cellulaire du GBM peuvent être observés au microscope optique car ils forment les caractéristiques cellulaires et tissulaires de la maladie. Les modifications de l'information génétique, entraînant l'altération, la suppression et l'expression des gènes par rapport à leurs niveaux physiologiques dans les astrocytes sains, conduisent non seulement à une réorganisation de la matrice cellulaire, mais aussi extracellulaire. Ces changements se traduisent par un nombre multiforme de formes micromorphologiques et purement immunologiques/biochimiques. Par conséquent, au XXIe siècle, le terme multiforme, auparavant exclu des nomenclatures, a acquis une nouvelle popularité sur fond de diversité génotypique dans cette entrée néoplasique.

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L'origine de l'expression de la vimentine dans le cancer du sein invasif : transition épithéliale-mésenchymateuse, histogenèse myoépithéliale ou histogenèse à partir de cellules progénitrices à potentiel de différenciation bilinéaire ?

L'expression de la vimentine est une découverte plutôt rare dans le cancer du sein invasif, et est associée à une invasion tumorale et à une chimiorésistance élevées. Il est actuellement expliqué par deux théories biologiques différentes : la dérivation histogénétique directe à partir de cellules myoépithéliales et la transition épithéliale-mésenchymateuse (EMT) reflétant le stade final de la dédifférenciation du cancer du sein. Dans cette étude, nous avons cherché à mieux comprendre les caractéristiques biologiques de ces cancers du sein exprimant la vimentine. Nous avons appliqué l'immunohistochimie pour la vimentine et 15 autres marqueurs de différenciation à une série de 364 cas de cancer du sein invasif, en utilisant la technologie des microréseaux tissulaires. 7,7 % de toutes les tumeurs exprimaient la vimentine. Presque tous ces cas (19/21) étaient des carcinomes canalaires invasifs de grade 3, et la majorité (13/21) d'entre eux étaient associés à un in situ composant. L'expression de la vimentine a également été observée dans les in situ composants et corrélée positivement avec l'expression de SMA, CD10, CK 5, p53, Mib-1 et EGFR. Une corrélation négative a été observée pour l'expression de CK 8/18 et le récepteur des œstrogènes. Les carcinomes exprimant la vimentine ont révélé un nombre absolu moyen d'altérations cytogénétiques significativement plus élevé par cas, mais une fréquence significativement plus faible de pertes du chromosome 16q par rapport aux cas sans vimentine. Nos résultats actuels démontrent que, malgré les analogies entre les cancers du sein vimentine-positifs et les cellules myoépithéliales dans leur expression de protéines liées à la différenciation, ni l'histogenèse myoépithéliale ni l'EMT ne peuvent expliquer exclusivement la biologie de ces tumeurs distinctes. Ceci est principalement étayé par l'incidence significativement plus élevée de cancers du sein exprimant la vimentine par rapport à toute autre tumeur myoépithéliale du sein et par le fait que la vimentine est déjà observée dans les canaux canalaires. in situ Composants. Nous proposons donc l'hypothèse alternative que les carcinomes mammaires exprimant la vimentine peuvent dériver de cellules progénitrices mammaires avec un potentiel de différenciation bilinéaire (glandulaire et myoépithéliale). Copyright © 2005 Société pathologique de Grande-Bretagne et d'Irlande. Publié par John Wiley & Sons, Ltd.


DISCUSSION

VIF inhibe la formation de lamellipodes

Nos résultats démontrent qu'il existe des gradients des différents états d'assemblage de la vimentine dans les fibroblastes en migration, comme indiqué par une concentration élevée de VIF dans la queue et les régions périnucléaires, une diminution relative du long VIF et une augmentation des gribouillis (court IF) et des particules non filamenteuses au sein de la lamelle, et un enrichissement en particules au sein du lamellipodium. Ainsi, les distributions des différents états d'assemblage de la vimentine sont corrélées avec la forme et la polarité des cellules locomotrices. A l'appui de ces observations, il a déjà été montré que la vimentine joue un rôle dominant dans les transitions de forme et l'augmentation de la motilité des cellules subissant l'EMT (Hendrix et al., 1997 Mendez et al., 2010). D'autres preuves ont été dérivées de la microinjection du peptide d'initiation de l'hélice mimétique de la vimentine 1A, qui désassemble le VIF principalement en monomères et dimères, provoquant l'arrondissage complet des fibroblastes et la perte de leurs attaches au substrat (Goldman et al., 1996). De plus, le silence d'autres protéines IF de type III telles que la protéine acide fibrillaire gliale et la périphérine provoque des changements de forme significatifs dans les cellules d'astrocytome et PC12, respectivement (Weinstein et al., 1991 Helfand et al., 2003).

Dans cette étude, nous montrons que le peptide mimétique de la vimentine, 2B2, désassemble le VIF en ULF, plutôt que les structures d'ordre inférieur résultant des expériences sur le peptide 1A (Goldman et al., 1996). De faibles concentrations de 2B2 micro-injectées dans des fibroblastes affamés de sérum ont souvent provoqué le désassemblage et la rétraction du VIF du bord de la cellule près des sites d'injection où les lamellipodes se sont formés. À des concentrations plus élevées, le peptide 2B2 provoquait fréquemment un désassemblage et une rétraction VIF plus étendus, et il induisait un froissement de la membrane autour de toute la surface cellulaire. Dans des expériences similaires, des régions périphériques non ébouriffantes de fibroblastes cultivés dans du sérum à 2 % ont été induites à ébouriffer par microinjection de 2B2, et par la suite ces cellules ont changé leur direction de translocation. Ces résultats démontrent que le démontage et la rétraction ciblés du réseau VIF du périmètre cellulaire peuvent induire un froissement de la membrane et altérer le mouvement cellulaire.

Nos résultats montrent également que la locomotion est inhibée dans les cellules vim −/−, les cellules silencieuses à la vimentine et les cellules exprimant la vimentine dominante négative.(1–138), même si, dans chacune de ces conditions expérimentales, les cellules sont ébouriffées sur l'ensemble de leur périmètre, ce qui indique que le VIF joue un rôle dans la motilité cellulaire. Cette inhibition de la motilité en l'absence de VIF normalement organisé peut être liée à l'incapacité des fibroblastes affectés à établir la polarité requise pour la motilité. Ainsi, la régulation du désassemblage de VIF peut agir comme un embrayage moléculaire qui module la machinerie à base d'actine responsable du déplacement des cellules. En revanche, lorsque les VIF sont polymérisés sous-jacents à la surface cellulaire, ils agissent comme un frein et un stabilisateur mécanique pour inhiber la formation de lamellipodes.

Les FI comme stabilisateurs mécaniques dans la régulation de la locomotion cellulaire

À l'appui de leur rôle de stabilisateurs mécaniques de la surface cellulaire, il a été démontré que les VIF résistent à des contraintes mécaniques significativement plus élevées in vitro que les microtubules ou les microfilaments, et ils présentent également des propriétés d'écrouissage et peuvent être étirés jusqu'à ∼3 fois leur longueur (Janmey et al., 1991 Kreplak et al., 2005, 2008). Ces caractéristiques sont inhérentes à tous les types de protéines IF cytoplasmiques (Lin et al., 2010). Le soutien in vivo de leurs rôles mécaniques est dérivé du fait que des mutations dans les protéines IF de la kératine ont été associées à des maladies vésiculeuses de la peau, dans lesquelles les kératinocytes deviennent fragiles et ont tendance à se rompre en cas de stress physique léger (Chan et al., 1994). Il a également été démontré que l'organisation des réseaux FI change rapidement en réponse aux forces de cisaillement (Helmke et al., 2000 Sivaramakrishnan et al., 2008). Par exemple, le cisaillement induit des changements dans la taille du maillage du réseau IF de la kératine, entraînant une augmentation de sa rigidité, démontrant davantage que le réseau IF fournit aux cellules un mécanisme pour résister aux forces mécaniques externes (Sivaramakrishnan et al., 2008). Il est probable que les propriétés de flexibilité et d'écrouissage de la FI pourraient contrôler localement la rigidité des régions d'une cellule, agissant ainsi comme déterminants de l'emplacement et du positionnement des lamellipodes.

La régulation locale de la rigidité cellulaire par VIF peut aider à expliquer le comportement des fibroblastes locomoteurs. Dans les descriptions originales d'Abercrombie (1961) des propriétés des membranes ébouriffées dans les fibroblastes en mouvement, il a observé qu'un premier lamellipodium cesse fréquemment de s'ébouriffer lorsqu'un nouveau ébouriffage se forme ailleurs sur la surface cellulaire, provoquant ainsi le déplacement de la cellule dans une direction différente. On sait peu de choses sur les facteurs qui déterminent le site de formation d'un lamellipode. Certes, cela implique une série d'interactions complexes entre les stimuli externes (par exemple, les facteurs de croissance), les récepteurs de la surface cellulaire, les voies de signalisation internes (par exemple, Rho et Rac) et la réorganisation des systèmes cytosquelettiques et de leurs protéines associées. Sur la base de nos résultats, nous émettons l'hypothèse que l'organisation locale du VIF participe à la détermination de ces sites. À l'appui de cela, nous avons constaté que les régions contenant relativement peu de VIF pourraient être induites à ébouriffer par beaucoup moins d'activation de PA-Rac1 que nécessaire dans les régions contenant plus de VIF. Ces résultats peuvent expliquer l'observation précédente selon laquelle certaines régions cellulaires nécessitaient une irradiation beaucoup plus importante que d'autres pour initier des lamellipodes après l'activation de PA-Rac1 (Wu et al., 2009).

La phosphorylation de la vimentine et la régulation de l'assemblage et de l'organisation des FI

La signification fonctionnelle de la découverte d'un enrichissement en particules de vimentine non filamenteuses dans les lamellipodes nouvellement formés est inconnue. Ces structures se sont avérées être des précurseurs dans l'assemblage de courts IF (gribouillis de Prahlad et al., 1998). Des précurseurs similaires à la kératine IF ont été rapportés dans les régions périphériques des cellules épithéliales (Windoffer et al., 2006). Bien que l'origine exacte des particules de vimentine reste à déterminer, il est probable qu'au moins certaines de ces structures résultent du désassemblage du VIF préexistant. Ce désassemblage est probablement régulé par des protéines kinases (par exemple, Lamb et al., 1989), car il a été démontré que la phosphorylation joue un rôle essentiel dans la régulation des états d'assemblage de VIF. Par exemple, la phosphorylation de Ser-55 dans le domaine N-terminal non hélicoïdal de la vimentine par Cdk1 est responsable du désassemblage du VIF en particules non filamenteuses lorsque les cellules s'arrondissent pour entrer en mitose (Chou et al., 1990). Cependant, la détermination de la pertinence de la phosphorylation lors de l'induction de l'ébouriffage est complexe, car la vimentine possède 53 sites de phosphorylation connus et putatifs (Li et al., 2002 Consortium, 2010). Parmi ceux-ci, 19 sites résident dans l'extrémité N-terminale, un domaine qui est connu pour jouer un rôle important dans la polymérisation de IF (Chou et al., 1991, 1996 Herrmann et al., 1996). Beaucoup de ces sites sont des cibles de kinases impliquées dans l'induction des lamellipodes et la motilité cellulaire. Il s'agit notamment de PI3Kγ (Barberis et al., 2009), ROKα (Sin et al., 1998), PKC (Inagaki et al., 1987), Raf-1 (Janosch et al., 2000), protéine kinase A (Howe, 2004), PAK (Goto et al., 2002) et AKT1 (Zhu et al., 2011). Vimentin Ser-38 est un site particulièrement intéressant car il est ciblé par au moins sept kinases, dont PAK, PKCε et AKT (Ando et al., 1989 Izawa et Inagaki, 2006 Zhu et al., 2011). Ces trois derniers sont connus pour être activés par Rac1 ou addition de sérum. À l'aide d'un anticorps dirigé contre la vimentine pSer-38, nous montrons qu'il y a une augmentation de ∼350 à 400 % de la phosphorylation à ce site coïncidant avec l'induction d'un froissement de la membrane. Ceci s'accompagne à la fois du désassemblage local du VIF près de la surface cellulaire et d'une augmentation du taux d'échange de sous-unités le long du VIF restant, comme indiqué par l'analyse FRAP. Fait intéressant, la photoactivation locale de PA-Rac1 dans un spot de ∼10-μm de diamètre est associée à une augmentation immédiate de la phosphorylation de Ser-38 uniquement dans la zone éclairée. Cette phosphorylation locale se propage rapidement le long du réseau VIF dans toute la cellule en <1 min. Pourtant, dans ces conditions expérimentales, nous pouvons détecter le désassemblage et la rétraction du VIF adjacent à la surface cellulaire uniquement à proximité du site initial d'activation de PA-Rac1.

Une explication possible du désassemblage local du VIF lors de la formation des lamellipodes pourrait être liée aux niveaux de phosphorylation de la vimentine. Par exemple, la conversion de VIF en particules et gribouillis vus sous-jacents aux volants peut nécessiter un niveau de phosphorylation plus élevé que celui nécessaire pour induire le renouvellement des sous-unités dans le reste du réseau VIF. Nos données FRAP après addition de sérum suggèrent que cela pourrait être le cas, car nous démontrons une augmentation du double du taux d'échange de sous-unités dans les réseaux VIF retenus dans les régions non associées à la membrane ébouriffée. D'autres facteurs compliquant notre compréhension de la régulation des états d'assemblage du VIF sont le grand nombre de kinases connues pour interagir avec la vimentine, la régulation des nombreux équilibres kinase/phosphatase impliqués dans la régulation des propriétés dynamiques du VIF et le nombre de résidus modifiés post-traductionnellement dans la chaîne protéique de la vimentine. Il est également possible qu'à la suite de la phosphorylation d'un site, des sites supplémentaires deviennent plus accessibles et donc plus susceptibles d'être phosphorylés. De cette manière, il est probable que plusieurs niveaux de régulation contribuent à l'état de l'assemblage de la vimentine. Pour commencer à déterminer le rôle de sites de phosphorylation spécifiques, nous avons initié des expériences préliminaires sur l'effet de l'addition de sérum à des cellules dépourvues de sérum et sans vimentine exprimant des réseaux d'une vimentine mutante non phosphorylable (S38A). À ce jour, nous n'avons pas détecté d'altération évidente de la réponse globale à l'ajout de sérum par rapport aux témoins (données non présentées). Ce résultat préliminaire suggère que de futures études utilisant la mutagenèse de plusieurs sites seront nécessaires pour déterminer le rôle de la phosphorylation dans la régulation des propriétés dynamiques des VIF, leur désassemblage et leur rétraction lors de la formation des lamellipodes.

Il convient de noter que certaines particules présentes dans les lamellipodes peuvent représenter une protéine nouvellement synthétisée. Le support de cette possibilité vient de la présence d'ARNm de vimentine à la pointe des cellules (Lawrence et Singer, 1986) ainsi que de la découverte que les particules de vimentine sont fréquemment associées à l'ARNm engagé dans le processus d'« assemblage cotraductionnel dynamique » (Chang et al., 2006). De plus, ces particules non filamenteuses peuvent avoir des fonctions distinctes de celles du VIF totalement polymérisé. Par exemple, il a été démontré au cours de la régénération axonale que la vimentine nouvellement synthétisée et non polymérisée forme un complexe avec la MAP kinase activée, l'importine-ß et la dynéine cytoplasmique avant le transport vers le noyau et la modulation subséquente de l'expression des gènes (Perlson et al., 2005). Il est également possible que les différentes structures de vimentine présentes dans les régions lamellaire/lamellipodiale soient impliquées dans la modulation des adhérences focales lors de la motilité cellulaire. À l'appui de cela, la vimentine a été associée à la distribution de complexes focaux contenant l'intégrine 3 (Bhattacharya et al., 2009), la régulation des intégrines 1 (Kim et al., 2010), et le taux de renouvellement de la paxilline, une « protéine adaptatrice » commune à toutes les adhérences focales (Mendez et al., 2010). Enfin, nous émettons l'hypothèse qu'au moins une sous-population de ces particules représente une forme de stockage pour l'assemblage de réseaux VIF qui agissent pour stabiliser mécaniquement la propagation du cytoplasme lorsqu'un fibroblaste avance en direction du premier lamellipodium.

Conclusion

Cette étude définit un rôle de la vimentine dans la régulation de la formation des lamellipodes et de la motilité cellulaire. Plus précisément, lorsque des réseaux de VIF sont assemblés et associés à la surface cellulaire, le froissement des membranes et la formation de lamellipodes sont inhibés. Inversement, le démontage régulé des VIF dans leurs blocs de construction structurels permet la formation de lamellipodes. En modulant la formation des lamellipodes, les VIF participent à la régulation de la polarité et de la motilité cellulaire.


Méthodes

Réactifs

HNE, 15-désoxy-Δ 12,14 -prostaglandine J2 (15j-PGJ2), prostaglandine A1 (PGA1) et leurs dérivés biotinylés provenaient de Cayman Chemical. Le diamide, le DBB, l'Iac-B, le TPEN, le Z-LLL ou le MG132, l'acide de Zinquin et l'ester éthylique de Zinquin, les anticorps anti-actine, anti-tubuline et anti-vimentine ont été obtenus auprès de Sigma. L'anticorps monoclonal anti-Hsp90 (sc-7947), anti-Lamp1 (sc-20011) anti-vimentine V9 (sc-6260) et ses conjugués Alexa488, Alexa405 et agarose ont été obtenus auprès de Santa Cruz Biotechnology. La vimentine de hamster syrien recombinante purifiée (numéro d'accès AH001833) provenait de Cytoskeleton, Inc. Les adduits anti-HNE Michael ont été obtenus auprès de Calbiochem. L'anticorps monoclonal anti-tubuline P1C3 a été le généreux don du Dr Isabel Barasoaín (Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC, Madrid, Espagne). LTR, phalloïdine-Alexa468 et phalloïdine-Alexa568 provenaient de Molecular Probes. L'inhibiteur de protéase Pefablock était de Roche.

Culture cellulaire et traitements

Les cultures cellulaires suivantes ont été obtenues du National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) Human Genetic Cell Repository du Coriell Institute for Medical Research (Candem, NJ) : Fibroblastes primaires humains de sujets témoins (AG10803) et de patients atteints d'EI (ONIM entrée 201100, lignée cellulaire GM02814A), et ont été manipulés selon les instructions du fournisseur. L'étude a été menée conformément aux principes de la Déclaration d'Helsinki et a été approuvée par la Commission de bioéthique et de biosécurité du Centro de Investigaciones Biológicas et par le Comité de bioéthique du Consejo Superior de Investigaciones Científicas (Espagne). Les cellules SW13/cl.2 déficientes en vimentine ont été généreusement offertes par le Dr A. Sarria 43 et ont été cultivées dans du DMEM additionné de 10 % (vol/vol) de sérum bovin fœtal et d'antibiotiques (100 U ml −1 pénicilline et 100 g ml − 1 streptomycine). Des cellules mésangiales de rat ont été obtenues à partir de reins de rat en utilisant une technique de tamisage gradué 40 et cultivées dans RPMI1640 avec des suppléments comme ci-dessus. Les cellules HeLa provenaient de l'American Type Cell Culture Collection. Pour les traitements, les cellules ont été cultivées en l'absence de sérum. Les traitements avec la Z-LLL pour l'inhibition du protéasome ont été effectués à 200 nM pendant 20 h. Du diamide a été ajouté pendant 20 min à 1 mM, lorsque cela est indiqué. TPEN a été utilisé pour l'épuisement du zinc dans les cellules à 10 M pour les temps indiqués.

Plasmides et transfections

Lamp1-GFP était le don généreux du professeur J. Lippincott-Schwartz (National Institutes of Health). Les constructions GFP-vimentine wt et GFP-vimentine C328S ont été précédemment décrites 40 . À partir de ces plasmides, la vimentine wt et C328S ont été sous-clonées dans les sites EcoRI et BamHI des plasmides bicistroniques pIRES2-AcGFP1 et pIRES2 DsRed-Express2, obtenus auprès de Clontech, pour produire des constructions qui expriment la protéine fluorescente et la vimentine non marquée en tant que protéines séparées. Ces constructions seront appelées GFP//vimentin wt ou C328S et RFP//vimentin wt ou C328S tout au long du manuscrit. Cette stratégie assure la surveillance des cellules exprimant la vimentine transfectée (respectivement GFP ou RFP positif) pour les distinguer des quelques cellules SW13 pouvant subir une réversion spontanée de l'expression de la vimentine. Les plasmides GFP-vimentine C328A et RFP//vimentine C328A ont été générés à partir de GFP-vimentine et RFP//vimentine wt, respectivement, en utilisant le kit de mutagenèse Quickchange XL de Stratagene avec les oligonucléotides : 5′-GGTGCAGTCCCTCACCGCTGAAGTGGATGCCC-3′ et son reverse complémentaire . Pour les transfections transitoires, les cellules des plaques p35 ont été transfectées avec 1 ug d'ADN en utilisant la Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Pour les tests de co-transfection, 1 g de plasmides bicistroniques codant pour la vimentine wt ou C328S non étiquetée et RFP pour l'identification des cellules transfectées (RFP//vimentine), ainsi que 0,2 g des constructions de fusion GFP-vimentine ont été utilisés. Pour la génération de cellules transfectées de manière stable, la sélection a été réalisée par culture en présence de 500 µg ml -1 de G-418 (Gibco) pendant au moins 3 semaines.

In vitro dosages pour la modification et la polymérisation de la vimentine

Pour la modification par divers électrophiles, la vimentine à 5 M dans 5 mM PIPES (pH 7,0) et 0,1 mM de dithiothréitol (DTT) a été incubée en présence des composés indiqués dissous dans du diméthylsulfoxyde. Dans ces dosages, de la vimentine soluble ou polymérisée a été utilisée. Dans le cas de l'incorporation de réactifs biotinylés, la détection de la biotine a été réalisée par incubation de transferts avec de la peroxydase de raifort (HRP)-streptavidine et une chimioluminescence améliorée (ECL). L'incorporation de HNE a été détectée avec un anticorps anti-HNE Michael adduits.

Pour la polymérisation, la vimentine a été incubée en présence de PIPES 5 mM (pH 7,0) et de NaCl 150 mM, pendant 5 à 20 min à 37 °C. Dans d'autres essais, la polymérisation a été induite par l'addition de divers sels de cations divalents, comme indiqué. L'effet de l'imidazole sur le ZnCl2la polymérisation induite a été évaluée par co-incubation avec 1 M d'imidazole. Pour la réversion de ZnCl2-polymérisation induite, vimentine polymérisée par incubation avec 500 M de ZnCl2 pendant 1 h a ensuite été incubé avec 1 mM de TPEN pendant 30 min. Dans tous les cas, la vimentine soluble (S) et polymérisée (P) a été séparée par ultracentrifugation à 100 000g pendant 30 min à 4°C, après quoi, des aliquotes du surnageant, contenant de la vimentine soluble, et des culots, remis en suspension dans du tampon Laemmli, ont été analysés par SDS-PAGE et WB.

Les tests de réticulation ont été réalisés en utilisant de la vimentine préincubée en l'absence ou en présence de 150 mM de NaCl, à 3 M, par incubation en présence de 20 M de DBB pendant 1 h à 37°C. Des aliquotes des incubations ont été séparées sur des gels SDS-polyacrylamide à 7,5% et analysées par WB.

Pour l'évaluation de la liaison au zinc, nous avons utilisé une modification d'une procédure récemment décrite pour la détection des protéines de liaison au zinc, qui est basée sur la réduction de l'incorporation d'une sonde réactive à la cystéine en présence de ce métal 66 . En bref, la vimentine purifiée a été polymérisée avec du NaCl 150 mM pendant 10 min à 37 °C avant d'être incubée pendant 1 h à température ambiante. avec 10 mM d'EDTA ou 500 M de ZnCl2, CaCl2 ou MgCl2. Par la suite, 10 uM de Iac-B ont été ajoutés pendant 30 min supplémentaires. L'incorporation d'Iac-B a été évaluée par SDS-PAGE et par transfert avec HRP-streptavidine et la quantité de vimentine par WB. Dans cet essai, l'incubation avec l'EDTA sert de contrôle pour éliminer les cations divalents potentiels liés à la protéine. Dans ce cas, puisque la vimentine est purifiée dans des conditions fortement dénaturantes, il n'est pas attendu que la protéine retienne les métaux conjugués.

Visualisation des structures de la vimentine par microscopie optique

Une aliquote de 5 l de vimentine à 10 M dans 5 mM PIPES (pH 7,0) et 0,1 mM DTT a été placé sur une lame de verre, et 5 l de 5 mM ZnCl2 solution a été ajoutée et mélangée avec la pointe de la pipette, après quoi, une lamelle a été placée sur la solution et l'échantillon a été visualisé sur un microscope confocal SP2 en utilisant le mode de contraste interférentiel différentiel pour l'acquisition d'images. Des dosages ont également été réalisés à 500 µM de zinc avec des résultats similaires. Pour la préparation de la vimentine fluorescente, la vimentine à 17 M a été incubée pendant 15 min à température ambiante. en présence d'un excès molaire 10 fois de FITC, après quoi, l'excès de FITC a été éliminé par filtration sur gel sur des colonnes de dessalage microspin Zeba (Thermo Scientific) en suivant les instructions du fabricant. Le FITC-vimentine a été mélangé avec de la vimentine non modifiée dans une proportion de 1:4 et traité comme ci-dessus pour la visualisation par microscopie optique. Pour la coloration Zinquin, 1 mM d'acide Zinquin a été ajouté à la vimentine-ZnCl2 mélange avant de placer la lamelle. Dans certains tests, le mélange de vimentine-ZnCl2, incubé pour la polymérisation comme ci-dessus, a ensuite été traité avec 2 mM de TPEN avant l'ajout de Zinquin. La fluorescence de Zinquin a été détectée par excitation avec un laser ultraviolet à 351 et 364 nm, et une émission entre 450 et 520 nm a été acquise.

Microscopie électronique

La vimentine à 3 M a été incubée en présence de divers sels à température ambiante. Les mélanges d'incubation ont été fixés avec 0,25 % de glutaraldéhyde immédiatement avant l'application sur des grilles en cuivre-palladium recouvertes de carbone. Après avoir éliminé l'excès d'échantillon, les grilles ont été lavées avec du tampon de polymérisation et colorées négativement avec 2 % d'acétate d'uranyle pendant 90 s. Des échantillons ont été observés dans un microscope électronique JEOL JEM-1230 fonctionnant à 100 kV équipé d'une caméra numérique CMOS TVIPS TemCam-F416 et obtenus à un grossissement de 50 K.

Immunofluorescence

Après les différents traitements, les cellules ont été fixées avec du paraformaldéhyde à 4 % pendant 25 min à température ambiante. Les cellules ont été perméabilisées avec 0,1 % de Triton X-100 dans du PBS, bloquées par incubation dans de l'albumine de sérum bovin à 1 % dans du PBS (solution de blocage) et incubées avec de l'anti-vimentine-Alexa488 ou les anticorps primaires indiqués à une dilution de 1:200 dans la même solution . Si nécessaire, des anticorps secondaires ont été utilisés à une dilution de 1:200 dans une solution de blocage. Les cellules ont été contre-colorées avec du 4,6-diamidino-2-phénylindole à 3 µg ml -1 dans du PBS pendant 15 min. Pour la visualisation de l'actine, les cellules ont été colorées avec Phalloidin-Alexa488 ou Alexa568, en suivant les instructions du fabricant. Les lysosomes ont été colorés avec LTR en incubant les cellules avec 25 nM LTR pendant 30 min à 37°C (réf. 67). Lorsque des lamelles ont été utilisées, elles ont été montées avec Fluorsave de Calbiochem.

Microscopie confocale

Les cellules ont été visualisées sur des microscopes Leica SP2 ou SP5. Des coupes individuelles ont été prises tous les 0,5 m avec une ouverture numérique de × 63, et les projections globales sont présentées, sauf indication contraire.

Pour les dosages FRAP, le microscope confocal Leica SP5 équipé d'une chambre thermostatée à 37°C a été utilisé. Brièvement, une image de pré-blanchiment a été prise, après quoi trois impulsions de puissance laser de 488 nm ont été appliquées pour blanchir une zone de 18 × 1,5 m. Les images post-blanchiment ont été acquises toutes les 3 s pendant 10 min à l'aide du logiciel de Leica. Pour l'analyse de la récupération de fluorescence, l'intensité en des points définis des filaments blanchis a été mesurée à différents moments avec le logiciel Fiji ImageJ 68 et exprimée en unités arbitraires pour tracer des graphiques de récupération. Au total, 20 dosages FRAP ont été effectués par condition expérimentale, 26 % en poids et 48 filaments C328S ont été contrôlés au total.

Pour l'estimation de l'épaisseur du filament de vimentine, des coupes transversales de plans de microscopie confocale uniques de fibroblastes colorés pour la vimentine par IF ont été tracées pour obtenir des profils à l'aide du logiciel Fidji ImageJ 68 . La largeur des pics d'intensité >50% d'intensité maximale a été mesurée individuellement, ainsi que le nombre de filaments par section cellulaire.

Pour la visualisation du zinc intracellulaire, les cellules cultivées sur des boîtes à fond de verre ont été incubées avec 25 M d'ester éthylique de Zinquin dans une solution saline équilibrée de Hank (HBSS) et observées sur un microscope Leica SP2 en utilisant une chambre thermostatée à 37 ° C. La fluorescence de Zinquin a été détectée avec les paramètres d'excitation et d'émission spécifiés ci-dessus.

Test d'expansion du réseau Vimentin

Les cellules SW13 transfectées de manière stable avec RFP//vimentin wt ou C328S ont été trypsinisées et étalées sur des lamelles de verre. Aux moments indiqués après l'étalement, les cellules ont été fixées et traitées pour l'IF avec un anticorps anti-vimentine. La position des noyaux a été obtenue par coloration au 4,6-diamidino-2-phénylindole et la surface occupée par le cytoplasme a été révélée par fluorescence RFP. Le motif du réseau de vimentine a été évalué par des observateurs indépendants de manière aveugle pour évaluer la proportion de cellules avec des filaments de vimentine circonscrits à la zone périnucléaire ou s'étendant vers la périphérie des cellules. Un minimum de 100 cellules par essai a été surveillé.

Essais de solubilité de la vimentine

La proportion de vimentine soluble et insoluble dans les cellules a été déterminée par extraction cellulaire avec un tampon détergent à haute teneur en sel (20 mM de Tris-HCl, pH 7,4, 600 mM de NaCl, 0,5 % de Triton X-100, 0,1 mM d'orthovanadate de sodium et d'inhibiteurs de protéase ( 2 μg ml -1 chacun de leupeptine, aprotinine et inhibiteur de trypsine, et 1,3 mM Pefablock) et séparation par centrifugation à 12 000g pendant 10 min à 4 °C (réf. 69). Des volumes égaux de fractions solubles et insolubles ont été analysés par SDS-PAGE et WB, et les disparités de charge protéique ont été surveillées par WB anti-actine. Non-saturated exposures from three independent experiments were analysed by image scanning, and the proportion of soluble vimentin was calculated with respect to total vimentin.

WB and immunoprecipitation

For SDS–PAGE, cells were lysed in 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.1 mM EDTA, 0.1 mM EGTA, 0.1 mM β-mercaptoethanol, containing 0.5% SDS, 0.1 mM sodium orthovanadate and protease inhibitors (2 μg ml −1 each of leupeptin, aprotinin and trypsin inhibitor, and 1.3 mM Pefablock). Aliquots containing 20 μg of protein were separated on SDS–polyacrylamide gels of the adequate percentage of polyacrylamide, as indicated. Gels were transferred to Immobilon-P membranes (Millipore) using the three buffer system recommended by the manufacturer. Blots were incubated with the antibodies against the proteins of interest (typically at 1:500 dilution) followed by secondary antibodies (HRP conjugated) at 1:2,000 dilution, and immunoreactive bands were detected with ECL (GE Healthcare). In some instances, lanes from the same gel have been cropped for presentation. This is indicated by dotted lines in figures and uncropped scans of blots are presented in Supplementary Fig. 6.

For vimentin immunoprecipitation, cells were lysed in 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.1 mM DTT and 0.5% SDS containing protease inhibitors. Lysates were diluted 1:5 in the same buffer in which SDS was substituted by 1% NP-40 and incubated overnight with anti-vimentin V9 agarose-conjugated antibody. Immunoprecipitates were washed four times with PBS and eluted by incubation at 95 °C for 5 min with Laemmli buffer.

Proteomic analysis

Immunoprecipitates obtained from 400 μg of lysates of DBB-treated HeLa cells with the anti-vimentin agarose-conjugated antibody were separated by SDS–PAGE. Gels were stained with Sypro Ruby and were visualized under ultraviolet light. The region of the gel corresponding to the DBB-induced oligomers detected by WB was excised and destained using 50 mM ammonium bicarbonate/50% acetonitrile (ACN), reduced with 10 mM DTT for 30 min at r.t., alkylated with 55 mM iodoacetic acid in the dark for 30 min at r.t. and digested with 12.5 ng μl −1 trypsin in 50 mM ammonium bicarbonate, overnight (o/n) at 30 °C. Peptides were extracted with ACN and 5% trifluoroacetic acid (TFA) and cleaned using ZipTips (0.6 μl C18 resin, Millipore).

Peptides were resuspended in 0.1% formic acid/2% ACN (buffer A) and analysed in an LTQ Orbitrap Velos (Thermo Scientific) in the positive ion mode, coupled to a nanoEasy HPLC (Proxeon). Peptides were first trapped onto a C18-A1 ASY-Column 2 cm precolumn (Thermo Scientific), and then eluted onto a Biosphere C18 column (C18, inner diameter 75 μm, 15 cm long, 3 μm particle size NanoSeparations) and separated using a 70-min gradient from 0 to 35% buffer B (buffer B: 0.1% formic acid in ACN) at a flow rate of 250 nl min −1 . Full-scan mass spectra (m/z 300–1,700) were acquired in the Orbitrap with a target value of 1,000,000 at a resolution of 30,000 at m/z 400, and the 15 most intense ions were selected for collision-induced dissociation fragmentation in the LTQ with a target value of 10,000 and normalized collision energy of 35%. Acquired spectra were searched against human UniProt database (090513) using Sequest search engine through Proteome Discoverer (version 1.4.1.14, Thermo). As for the search parameters, precursor and fragment mass tolerance were set to 10 p.p.m. and 0.8 Da, respectively. Carbamidomethylation of cysteines was set as a fixed modification, and oxidation of methionines was set as a dynamic modification. Two missed cleavages were allowed. Identified peptides were validated using Percolator algorithm with a q value threshold of 0.01 and those with a high confidence level were accepted. The number of peptides from any given identified protein matching these criteria is referred to as peptide spectrum match.

PAR-competition assays

Assays for the competition between PAR and vimentin were based in the procedure described by Koch et al. 51 , with the following modifications: PAR was used at 100 μM final concentration and vimentin at 1 μM. The assay was carried out in 5 mM PIPES, pH 7.0, at r.t. Assays were started by the addition of ZnCl2 solution to give final concentrations between 1 and 100 μM. The formation of the ZnPAR2 complex (K of ZnPAR2, 3 × 10 −13 ref. 51) was determined photometrically at 492 nm. No significant changes in absorbance were observed during the time of the assay (typically 10 min). In some assays, vimentin was preincubated with 20 mM MgCl2 for 50 min, after which ZnCl2 was added. In this case, changes in absorbance with time were followed. PAR samples received an equivalent amount of MgCl2, which did not affect colour development.

Analyses statistiques

All experiments were repeated at least three times. For experiments involving visual inspection of morphological features, preparations were evaluated by two independent observers in a blind fashion, and, unless otherwise stated, at least 50 cells were monitored per experimental condition. All results are presented as average values±s.e.m. Statistical differences were evaluated by the Student’s t-test and were considered significant when P<0.05, which is denoted in graphs by an asterisk.


Remerciements

We thank Nai He Jin (Institute of Biochemistry and Cell Biology, Chinese Academy of Science, Shanghai, China) for assistance with nestin staining. We thank Xiao Yan Ding (Institute of Biochemistry and Cell Biology, Chinese Academy of Science, Shanghai) and Bing Liu (Beijing Institute of Basic Medical Sciences, Beijing) for their critical reading of the manuscript. We would also like to thank all the members of our laboratory for their help in this study. This work was supported by the National Basic Research Program of China (G1999054300, 2005CB522705), Shanghai Science and Technology Development Foundation.


Etymology of vimentin - Biology

a Institute for X-Ray Physics, University of Göttingen, 37077 Göttingen, Germany
E-mail: [email protected]

b Cluster of Excellence “Multiscale Bioimaging: from Molecular Machines to Networks of Excitable Cells” (MBExC), University of Göttingen, Germany

Résumé

Despite the importance for cellular processes, the dynamics of molecular assembly, especially on fast time scales, is not yet fully understood. To this end, we present a multi-layer microfluidic device and combine it with fluorescence fluctuation spectroscopy. We apply this innovative combination of methods to investigate the early steps in assembly of vimentin intermediate filaments (IFs). These filaments, together with actin filaments and microtubules, constitute the cytoskeleton of cells of mesenchymal origin and greatly influence their mechanical properties. We are able to directly follow the two-step assembly process of vimentin IFs and quantify the time scale of the first lateral step to tens of ms with a lag time of below 3 ms. Although demonstrated for a specific biomolecular system here, our method may potentially be employed for a wide range of fast molecular reactions in biological or, more generally, soft matter systems, as it allows for a precise quantification of the kinetics underlying the aggregation and assembly.


<p>This section provides information on the quaternary structure of a protein and on interaction(s) with other proteins or protein complexes.<p><a href='/help/interaction_section' target='_top'>More. </a></p> Interaction i

<p>This subsection of the <a href="http://www.uniprot.org/help/interaction%5Fsection">'Interaction'</a> section provides information about the protein quaternary structure and interaction(s) with other proteins or protein complexes (with the exception of physiological receptor-ligand interactions which are annotated in the <a href="http://www.uniprot.org/help/function%5Fsection">'Function'</a> section).<p><a href='/help/subunit_structure' target='_top'>More. </a></p> Subunit structure i

Homomer assembled from elementary dimers (By similarity). Identified in complexes that contain VIM, EZR, AHNAK, BFSP1, BFSP2, ANK2, PLEC, PRX and spectrin (PubMed:21745462).

Interacts with BCAS3 (By similarity).

Interacts with LGSN (PubMed:18178558).

Interacts with SYNM (PubMed:17356066).

Interacts (via rod region) with PLEC (via CH 1 domain) (PubMed:15128297).

Interacts with STK33 (By similarity).

Interacts with LARP6 (By similarity).

Interacts with RAB8B (By similarity).

Interacts with TOR1A the interaction associates TOR1A with the cytoskeleton (PubMed:18827015).

Interacts with TOR1AIP1 (By similarity).

Interacts with DIAPH1 (By similarity).

Interacts with EPPK1 interaction is dependent of higher-order structure of intermediate filament (By similarity).

Interacts with the non-receptor tyrosine kinase SRMS the interaction leads to phosphorylation of VIM (By similarity).

Interacts with NOD2 (By similarity).

Interacts (via head region) with CORO1C (PubMed:27178841).

Interacts with HDGF (By similarity).

Interacts with PRKCE (via phorbol-ester/DAG-type 2 domain) (By similarity).

Interacts with BFSP2 (PubMed:19029034).

Interacts with PPL (PubMed:19029034).

Manual assertion inferred from sequence similarity to i

Manual assertion based on experiment in i

<p>This subsection of the '<a href="http://www.uniprot.org/help/interaction%5Fsection">Interaction</a>' section provides information about binary protein-protein interactions. The data presented in this section are a quality-filtered subset of binary interactions automatically derived from the <a href="https://www.ebi.ac.uk/intact/">IntAct database</a>. It is updated at every <a href="http://www.uniprot.org/help/synchronization">UniProt release</a>.<p><a href='/help/binary_interactions' target='_top'>More. </a></p> Binary interactions i

P20152

GO - Molecular function i

Protein-protein interaction databases

The Biological General Repository for Interaction Datasets (BioGRID)

CORUM comprehensive resource of mammalian protein complexes

Database of interacting proteins

Protein interaction database and analysis system

Molecular INTeraction database

STRING: functional protein association networks

Miscellaneous databases

RNAct, Protein-RNA interaction predictions for model organisms.


Résultats

Loss of Vimentin Leads to Deficient Wound Healing.

Burns or excisional skin wounds in mice are common experimental approaches to assess molecular, cellular, and tissue movements associated with repair. To determine whether vimentin is an important determinant in wound healing, full-thickness standardized burn wounds (1 cm in diameter) were induced in 8- to 10-wk-old VIM −/− mice and their WT littermates. A histological analysis of wound morphology 9 d after injury revealed epidermal healing of only 17% reepithelialization of the wounds in VIM −/− mice compared with 32% in the WT group (Fig. 1 UNE et B). At day 15 postinjury the wounds in WT mice were reepithelialized completely, with a prominent keratinized layer (Fig. 1 UNE et B). In contrast, the epithelium layer in VIM −/− mice remained open (∼56% reepithelialization) and in many mice was still covered by a large scab (Fig. 1 UNE et B). Furthermore, the wound-closure area, quantified at different time points following injury, showed that from day 4 postinjury healing was significantly slower in the VIM −/− group than in the WT group (Fig. 1 C et ). As shown in Fig. 1E, the time to healing (i.e., when the scab falls off) was ∼3 d longer in the VIM −/− group than in WT group. As with burn wounds, the healing of excisional wounds was severely impaired in VIM −/− mice (Fig. S1). To examine the possible influence of basal skin conditions on wound healing, we analyzed the overall features of uninjured control skin of prenatal mice at embryonic day 14 (E14), preweaning (18-d-old) mice, and adult mice (age 10 wk old up to 10 mo) (Fig. S2). In this examination of the uninjured skin, no striking differences in the organization of epidermis, dermis, and cell components could be observed between WT and VIM −/− skins (Fig. S2 UNE). The results demonstrate that loss of vimentin inhibits normal wound healing, resulting in a slow and incomplete recovery of the tissue.

VIM −/− mice display wound-healing defect in a burn wound model. (UNE) Representative pictures showing immunohistochemical labeling of pan-keratin in WT and VIM −/− wounds on days 9 (D9) and 15 (D15) postinjury. (Scale bar, 100 μm.) (B) Quantification of the percentage of wound reepithelialization at different time points after wounding in VIM −/− and WT wounds. Data are shown as means ± SEM m = 6. (C) Representative wound pictures from VIM −/− and WT mice during the 15-d wound-healing period. () Quantification of the remaining wound area at different time points after wounding in WT and VIM −/− groups. Data are shown as means ± SEM m = 6–12. (E) Comparison of the healing times (scab falling off) in the days after wounding. Data are shown as means ± SEM m = 12. *P < 0.05 **P < 0.01 ***P < 0,001.

VIM −/− mice have slower wound healing in an excisional wound model (related to Fig. 1). (UNE) Representative pictures of immunohistochemical labeling of pan-keratin in wounds in VIM −/− and WT mice on days 9 (D9) and 15 (D15) postinjury. (B) Representative pictures of wounds in WT and VIM −/− mice 15 d after excisional injury. (C) Quantification of the wound area remaining at different time points after wounding in the WT and VIM −/− groups. Data are shown as means ± SEM m = 4. *P < 0.05 **P < 0.01 ns, not significant.

Vimentin control mice have normal skin composition and collagen accumulation (related to Figs. 2 and 5). (UNE) Representative pictures showing immunohistochemical labeling of pan-keratin in uninjured skin from control mice on E14 and from 18-d-old, 10-wk-old, and 10-mo-old mice. (B) Representative confocal pictures of immunofluorescent labeling of N-cadherin (red) and keratin 5 (K5, green) in skins of uninjured control mice. (C et ) Quantitation of K5 + DAPI + cells (C) and N-cadherin + DAPI + cells () in the epidermal and dermal region. (E) Representative pictures of Picro-Sirius Red staining of collagen in the corresponding sections of skins from VIM −/− and WT control mice. (F) The quantitation of collagen accumulation (Picro-Sirius Red-positive areas) in the mesenchymal/dermal regions of wounds. Dans UNE, B, et E, D, dermis region E, epidermis region. (Scale bars, 100 μm.) In C, , et F, data are shown as means ± SD m = 2–4.

The Defect in Reepithelialization Is Associated with an Inactive EMT Program in VIM −/− Wounds.

To evaluate skin reepithelialization during wound healing further, we analyzed the keratinocytes at wound margins, which form a coordinated cell sheet with de novo production of injury-specific keratin proteins, such as keratin 6, 14, and 16 (25, 26). WT wounds had higher keratin 6 intensity than VIM −/− wounds at days 9 and 15 postinjury (Fig. 2UNE), and a similar tendency was observed for keratin 14 and with labeling by a pan-keratin antibody (Fig. 2 B et C). By day 15 postinjury, keratinocyte colonies had fused successfully with the newly formed stratified mature epidermis in WT wounds. In contrast, reepithelialized VIM −/− wound regions displayed a very thin epidermal layer with a large scab (right images in Fig. 2 UNE et B) the average thickness of pan-keratin + epidermis was barely 30.5% of that in the WT group (Fig. 2). Furthermore, certain regions of keratinocyte colonies in the epidermis of VIM −/− wounds were poorly organized (Fig. 2C). These observations imply that migration, maturation, and stratification of the epidermis, all prerequisites for fast, spontaneous wound healing, are severely compromised in the VIM −/− group.

Compromised reepithelialization and EMT differentiation in VIM −/− wounds. (UNE et B) Representative pictures of confocal images of keratin 6 (green) and DAPI (red) (UNE) and keratin 14 (green) and DAPI (red) (B) in VIM −/− and WT wounds on day 9 and 15 after skin burn injury. D, dermis region S, scab region. (Scale bars, 200 μm.) (C) Representative confocal images of keratin expression as visualized by a pan-keratin antibody (green), vimentin (red), and DAPI (blue) in VIM −/− and WT wounds on day 15 postinjury. White arrows indicate the region of thin and poor keratinization in VIM −/− wounds. () Quantification of average epidermis thickness on day 15 after burn injury. Bars indicate the mean fold changes relative to WT ± SEM m = 3. (E) qRT-PCR analysis of mRNA transcripts for Slug, N-cadherin (Cdh2), FSP-1 (S100a4), and fibronectin (Fn1) in isolated epidermal regions of VIM −/− and WT wounds on days 0, 3, 9, and 15 after burn injury. Bars indicate the mean fold changes ± SEM relative to day 0 WT **P < 0.01 m = 3.

EMT or an EMT-like transdifferentiation program induces the transient transition of secondary epithelial cells to a more migratory phenotype, which is critical for rapid reepithelialization of injured epithelium (27, 28). To address the role of vimentin in this process, we analyzed whether the absence of vimentin affects EMT during wound repair in injured epidermis. We found that during normal WT wound closure, the expression of a major EMT initiator, the transcription factor Slug (also termed Snai2), remained at the same levels found in samples of day 0 uninjured WT skin until day 3 (Fig. 2E). In the WT injured skin samples, the expression of Slug mRNA increased dramatically from day 0 until day 9 and then ceased by day 15 (Fig. 2E). In comparison, skin samples from VIM −/− mice showed significantly reduced mRNA expression of Slug during wound healing we observed a 4.7-fold reduction on day 3 and a prominent 11.5-fold reduction on day 9 in the wounds of VIM −/− mice as compared with their WT littermates (Fig. 2E). On day 15, Slug expression returned to similar levels in WT and VIM −/− wounds (Fig. 2E), in accordance with previously observed kinetics of transient Slug induction in several skin-injury studies (3, 29). Correspondingly, the mRNA expression of EMT-dependent markers downstream of Slug, including N-cadherin (Cdh2), fibroblast-specific protein 1 (S100a4), and fibronectin (Fn1) (30), increased until day 9 and decreased by day 15 during normal WT wound closure (Fig. 2E). The baseline expression of these genes in skin samples from VIM −/− mice were at the same levels as in day 0 WT skin samples but dropped drastically during wound healing, especially at day 9 (Fig. 2E), further supporting the vimentin dependence of the Slug–EMT response during wound repair.

We also found keratin + cell colonies at the WT epidermis–dermis interface that were absent in VIM −/− wounds at day 9 postinjury (Fig. S3 UNE et B). Additionally a significant portion of cells in the dermal regions of WT wounds coexpressed keratin and the mesenchymal marker α-SMA (Fig. S3C) at day 9 postinjury. Another mesenchymal marker, N-cadherin, was coexpressed with keratin 5 in WT epidermal cells on day 15 postinjury (Fig. S3 E et F). Such cells, which may be at the intermediate stages of EMT, with continued expression of epithelial markers but acquiring the expression of mesenchymal markers, were much less abundant in the healing VIM −/− skin (Fig. S3 CF). Therefore, in the absence of vimentin, the consequent dysfunction of the EMT program is likely to be a primary reason for the inhibited reepithelialization during wound repair in our models.

Compromised reepithelialization and keratinocyte transdifferentiation in VIM −/− wounds (related to Fig. 2). (UNE) Representative confocal images of the expression of pan-keratin (green) and DAPI (blue) in wounds of VIM −/− and WT mice on day 9 postinjury (D9). The white arrowheads indicate examples of migrating pan-keratin + cell colonies locating in the dermis–epidermis interface. (Scale bar, 100 μm.) (B) Quantitation of pan-keratin + cell colony numbers in dermis–epidermis interface regions on day 9 postinjury. (C) Representative confocal images of the expression of α-SMA (red) and pan-keratin (green) in VIM −/− and WT wounds on day 9 postinjury. The white arrowheads indicate examples of pan-keratin + α-SMA + cells in the dermal region of WT wounds on day 9 postinjury. (Scale bars, 20 μm.) () Quantitation of pan-keratin + α-SMA + cells in wounds in VIM −/− and WT mice on day 9 postinjury. (E) Representative pictures of immunofluorescent labeling of keratin 5 (green) and N-cadherin (red) in wounds of VIM −/− and WT mice on day 15 postinjury (D15). (Scale bar, 100 μm.) (F) Quantitation of N-cadherin + K5 + cells in epidermis in day 15 wounds. Dans UNE et E, E: epidermis region D: dermis region. Dans B, , et F, data are shown as means ± SEM m = 3. **P < 0.01.

TGF-β Derived from Dermal Fibroblasts Triggers the Slug–EMT Program and Epithelial Cell Migration.

An EMT-like keratinocyte transdifferentiation program can be modulated rapidly by a variety of factors in the wound environment (31, 32). Therefore we explored the possible involvement of these signaling factors by gene-expression profiling and found that TGF-β1 (Tgfb1), a primary inducer of EMT, had a significantly lower expression at day 3 and day 9 postinjury in VIM −/− wound tissues than in their WT counterparts (Fig. 3UNE). Recombinant TGF-β1 potently inhibited the expression of the epithelial markers desmoplakin and E-cadherin and induced the expression of Slug, N-cadherin, and vimentin (all hallmarks of an EMT-like transdifferentiation process) in mouse keratinocytes following cytokine stimulation (Fig. 3 B). To examine the involvement of Slug in wound healing-mediated EMT, we silenced Slug expression in keratinocytes using Slug siRNA in the absence or presence of TGF-β1 (Fig. 3 E et F). Keratinocytes transfected with Slug siRNA had reduced expression of N-cadherin and vimentin as well as a slight induction of desmoplakin upon TGF-β stimulation (Fig. 3 Eg), indicating that Slug is needed to induce EMT downstream of TGF-β. Taken together, these data suggest that TGF-β1 produced in WT wounds is capable of driving an active EMT transdifferentiation program via Slug.

TGF-β1–Slug signaling promotes keratinocyte differentiation and migration. (UNE) qRT-PCR analysis of transcripts for TGF-β1 (Tgfb1) in VIM −/− and WT wounds on days 3, 9, and 15 after wounding. Bars show mean fold changes ± SEM relative to WT m = 3. (B) Mouse keratinocytes were stimulated with 5–10 ng/mL TGF-β1 for 0, 3, or 5 d. Cell lysates were collected and blotted with antibodies against desmoplakin, E-cadherin, N-cadherin, vimentin, and Hsc-70 as loading control. (C et ) Quantification of Slug (C) and N-cadherin () intensity in B equalized to Hsc-70. Bars show mean fold changes ± SEM relative to day 3 control mice m = 3. (E) Mouse keratinocytes were transfected with scramble siRNA (si Scra) or Slug siRNA (si Slug) oligos for 2 d and then were stimulated with 5 ng/mL TGF-β1 for 3 d. Cell lysates were collected for Western blotting analysis of Slug, N-cadherin, vimentin, desmoplakin, and loading control Hsc-70. (F et g) Quantification of Slug (F) and N-cadherin (g) intensity in E equalized to Hsc-70. Bars show the mean fold changes ± SEM relative to mock transfections (Ctrl) m = 3 *P < 0.05 **P < 0.01 ***P < 0.001 ns, not significant.

Because vimentin as a mesenchymal marker is expressed mainly in dermal compartments, we postulated that activated dermal fibroblasts would be responsible for the TGF-β production observed upon injury, thereby triggering epidermal keratinocyte transdifferentiation. In support of this hypothesis, we found that mouse dermal fibroblasts (MDFs) isolated from VIM −/− mice have lower TGF-β1 gene expression than MDFs from WT mice (Fig. 4UNE). Correspondingly, the levels of active TGF-β1 in the supernatants of VIM −/− MDFs were significantly lower than in the supernatants of WT MDFs (Fig. 4B). Cell-culture supernatants of WT MDFs containing greater amounts of TGF-β1 induced a stronger EMT program in the cultivated mouse keratinocytes than did supernatants from VIM −/− MDFs (Fig. 4C). Consistently, in a scrape-wound assay, mouse keratinocytes closed the scrape wounds considerably faster in the presence of conditioned medium from WT MDFs than in conditioned medium from VIM −/− MDFs (Fig. 4 et E). To exclude the involvement of other cellular effectors of inflammation that might be relevant to the keratinocyte phenotype, we assessed the expression of key cytokines and the presence of inflammatory cells during wound repair. We found that the expression of the mRNA of proinflammatory cytokines IL-6 (Il6), IL-1α (Il1a), IL-1β (Il1b), IL-23 (Il23), and TNF-α (Tnf) remained at similar levels (less than 1.5-fold changes) between WT and VIM −/− wounds on day 3 and day 9 postinjury (Fig. S4UNE). Although on day 9 postinjury, 1.5-fold fewer neutrophil cells had infiltrated to the edges of WT wounds than to the edges of VIM −/− wounds (Fig. S4 B et C), there was no significant change in the myeloperoxidase activity of neutrophils (MPO + ) in WT and VIM −/− wounds at day 9 postinjury (Fig. S4 et E). In addition, the presence of macrophages (CD11b + ) and activated T cells (Zap-70 + ) was comparable between WT and VIM −/− wounds on day 9 of wound repair (Fig. S4 et E). Cell-culture supernatants of WT and VIM −/− macrophages also contained equal levels of TGF-β1 (Fig. S4F), demonstrating that the loss of vimentin in the regional fibroblasts, but not the infiltrated inflammatory cells, is the key effector of insufficient TGF-β production and signaling.

Vimentin promotes TGF-β production from fibroblasts driving EMT and migration of keratinocytes. (UNE) qRT-PCR analysis of transcripts for TGF-β1 (Tgfb1) in VIM −/− and WT MDFs. Bars show mean fold changes ± SEM relative to WT m = 6. (B) Level of active and latent forms of TGF-β1 in the supernatants of 6-d MDF cell cultures were analyzed by ELISA. Data are shown as mean ± SEM m = 3. (C) VIM −/− and WT MDF cell-culture media were extracted on 0, 3, and 6 d after cell growth. The growth medium of mouse keratinocytes was replaced with the MDF-conditioned medium for 5 d. Cell lysates were collected and blotted with antibodies against desmoplakin, E-cadherin, N-cadherin, vimentin, Slug, and loading control GAPDH. ( et E) In vitro wound-healing assay of mouse keratinocytes grown in 6-d conditioned medium from VIM −/− MDFs and WT MDFs. The cell gap was monitored over 24 h, and the wound areas were measured and plotted against the time point. At least four wound scratches were analyzed per experiment. Data are shown as means ± SEM m = 3. (F) Mouse keratinocytes grown in 6-d conditioned medium from the VIM −/− and WT MDFs were treated with control IgG (Ctrl IgG, 10 μg/mL), pan–TGF-β neutralizing antibody 1D11 (1D1 Ab, 10 μg/mL), two chemical inhibitors of TGF-β receptors [LY2109761 (2 μM) and SB431542 (2 μM)] or were grown in the corresponding DMSO control (DMSO, 2 μM) for 3 d. The cell lysates from this experiment were blotted with antibodies against pSmad2/3, total Smad2/3, Slug, N-cadherin, and loading control GAPDH. (g et H) Quantification of Slug and N-cadherin intensity in F equalized to GAPDH bars show the mean fold changes relative to WT Ctrl IgG ± SEM m = 3. (je) In vitro wound-healing assay of mouse keratinocytes (at 16 h of wound healing) in the treatments in F. (J) The oui axis shows the percentage of area covered (at 16 h of wound healing) by keratinocytes transfected with mock, scramble siRNA (si Scra), or Slug siRNA (si Slug) oligos for 2 d and incubated in 6-d WT or VIM −/− MDF-conditioned medium. Dans je et J, at least four wound scratches were analyzed per experiment. Data are shown as means ± SEM m = 3 *P < 0.05 **P < 0.01 ***P < 0,001.

Inflammatory cytokines and infiltrated inflammatory cells in wounds in WT and VIM −/− mice (related to Fig. 4). (UNE) qRT-PCR analysis of transcripts for IL-6 (Il6), IL-1α (Il1a), IL-1β (Il1b), IL-23 (Il23), and TNF-α (Tnf) in wounds in VIM −/− and WT mice on days 3 (D3), 9 (D9), and 15 (D15) after wounding. Data are shown as means ± SEM m = 3. (B) Representative pictures of immunohistochemical labeling of mouse neutrophils in wounds in VIM −/− and WT mice on days 3 and 9 postinjury. The inflamed tissue is indicated by black dashed lines. (Scale bars, 20 mm.) (C) Comparison of the temporal regulation of inflammation (the wound-edge regions infiltrated with neutrophils) in wounds in VIM −/− and WT mice. Data are shown as means ± SEM m = 3. ( et E) Representative pictures () and quantitative comparison (E) of the myeloperoxidase activity of neutrophils (MPO), monocyte/macrophage marker CD11b, and T-cell marker Zap-70 in the wound-edge regions of wounds in VIM −/− and WT mice 9 d after injury. (Scale bar, 100 μm.) Data in E are shown as mean ± SEM m = 3. (F) Level of active and latent forms of TGF-β1 in the supernatants after 6 d of WT and VIM −/− macrophage cell culture were analyzed by ELISA. Data are shown as means ± SEM m = 5. *P < 0.05 **P < 0.01 ***P < 0.001 ns, not significant.

To test further whether TGF-β1 produced from MDFs is required to drive EMT-like changes in keratinocytes, a pan–TGF-β neutralizing antibody, 1D11, and two chemical inhibitors of TGF-β receptors, LY2109761 and SB431542, were added to MDF-conditioned medium all effectively inhibited the phosphorylation of Smad2/3 (Fig. 4F), downstream effectors of the TGF-β signaling pathway. Further corroborating the involvement TGF-β signaling were the results showing that when TGF-β signaling was blocked, the expression of EMT markers (Slug and N-cadherin) in keratinocytes was reduced (Fig. 4 g et H), and cell migration was inhibited (Fig. 4je). This effect was prominent in cells incubated in the presence of WT MDF supernatants (Fig. 4 gje), which contained higher levels of active TGF-β1 than VIM −/− MDF supernatants (Fig. 4B), reinforcing the notion that TGF-β signaling is a major driver in keratinocyte transdifferentiation and migration induced by fibroblast vimentin. Inhibition of Slug expression by siRNA in keratinocytes also inhibited cell migration (Fig. 4J), further demonstrating that vimentin regulates keratinocyte migration through TGF-β –Slug signaling.

Vimentin Promotes Fibroblast Proliferation, Collagen Accumulation, and Paracrine EMT Signals.

At later stages of tissue repair, we found that the VIM −/− wounds displayed a striking reduction in s.c. proliferating fibroblasts, as indicated by the loss of cells positive for the proliferation marker nuclear antigen ki67 (Fig. 5 UNE et B). To assess whether this fibroblast deficiency would lead to a defect in ECM synthesis and buildup, we analyzed the accumulation of dermal collagen using Picro-Sirius Red staining (33). The normal granulation tissue with thick collagen fibers that was observed in WT wounds could not be observed in VIM −/− wounds, which instead showed either no fibers or at best a few scattered thin fibers (Fig. 5C). At 15 d postinjury, a striking difference was observed between WT and VIM −/− wounds: Collagen accumulation was largely absent in the dermal regions of VIM −/− wounds, whereas the majority (∼95%) of WT dermis was occupied by collagen fibers (Fig. 5). There was no striking difference in collagen accumulation between normal, uninjured WT and VIM −/− adult skins (Fig. S2 E et F, 10 wk), excluding the possibility of a problem in s.c. collagen distribution in uninjured basal skin. Therefore the collagen defect can be attributed entirely to events during wound healing, and the observed absence in reepithelialization in VIM −/− wounds is closely associated with the inhibition of fibroblast proliferation and collagen accumulation.

Vimentin promotes mesenchymal cell proliferation and collagen accumulation in vivo. (UNE) Representative confocal images of the expression of Ki67 (punctate green signal in the nucleus) and vimentin (red) in VIM −/− and WT wounds on days 9 (D9) and 15 (D15) after burn wounding. Nuclei were counterstained with DAPI (blue). (Scale bars, 20 μm.) The white arrowheads indicate examples of ki67 + cells in dermal regions. D, dermis region E, epidermis region. (B) Quantitation of ki67 + cells in mesenchymal/dermal regions of wounds. (C) Representative pictures of Picro-Sirius Red staining of collagen (Upper) and the immunohistochemical labeling of pan-keratin (Lower) in the corresponding sections of VIM −/− and WT wounds on day 15 postinjury. The right lower corner of each panel shows an enlarged image of the area in the white box. (Scale bars, 100 μm.) () The quantitation of collagen accumulation (Picro-Sirius Red-positive areas) in mesenchymal/dermal regions of wounds. Dans B et data are shown as means ± SEM m = 3 *P < 0.05 **P < 0.01.

To investigate further whether vimentin plays a direct role in dermal fibroblast proliferation, we compared the proliferative potential of VIM −/− and WT MDFs. The results showed that VIM −/− MDFs grew much more slowly than WT MDFs (Fig. 6UNE), although the apoptotic rates in VIM −/− and WT MDFs were similar (Fig. S5UNE). To determine whether vimentin expression is required for the growth advantage, exogenous vimentin construct was titrated into VIM −/− MDFs. We found that reconstitution of vimentin in VIM −/− MDFs restored the cell proliferation capacity in a dose-dependent manner (Fig. 6UNE) that was associated with the reactivation of ERK1/2 signaling (Fig. 6B). Furthermore, the conditioned medium from these VIM −/− MDFs reexpressing increasing levels of vimentin gradually rescued the EMT and migration defect in keratinocytes (Fig. 6 C et ). These results suggest that the presence of vimentin in fibroblasts not only directly regulates the proliferation of these cells but also drives the transdifferentiation of keratinocytes by TGF-β1–mediated paracrine mechanisms.

Vimentin promotes mesenchymal cell proliferation and paracrine EMT signaling in vitro. (UNE) The growth curve of VIM −/− and WT MDF cells after transfected with different amounts of vectors encoding full-length vimentin (the total DNA per transfection was equalized with the control vector). Data are shown as mean ± SEM m = 3. (B) Immunoblotting of vimentin, pERK1/2, total ERK1/2, and GAPDH expression of the cell lysates in UNE. (C et ) Western blotting of individual markers (C) and migration () of mouse keratinocytes growing in 6-d conditioned medium (D6) from VIM −/− and WT MDFs transfected with the indicated amount of vimentin plasmids. Data are shown as means ± SEM m = 3. (E) Scheme showing the working model. Vimentin has a profound effect on fibroblast proliferation, which activates both collagen production and TGF-β secretion. The active fibroblast TGF-β induces Slug–EMT signaling in keratinocytes, promoting EMT-like transdifferentiation and keratinocyte migration.

Vimentin does not influence fibroblast survival (related to Fig. 6). (UNE) The cell-survival curve of VIM −/− and WT MDFs after transfection with different amounts of vectors encoding full-length vimentin (the total DNA per transfection was equalized with the control vector). Data are shown as means ± SEM m = 3. (B) Representative confocal pictures of immunofluorescent labeling of DAPI (blue), keratin 5 (green), and vimentin (red) (La gauche) or keratin 14 (green) and N-cadherin (red) (Droit) from isolated mouse keratinocytes. (Scale bars, 20 μm.)

Taking these results together, we have been able to validate the conceptual framework derived from in vivo observations by in vitro experiments with dermal fibroblasts and keratinocytes isolated from VIM −/− and WT mice. Our working model summarized in Fig. 6E proposes that vimentin orchestrates wound healing by regulating fibroblast proliferation and thereby both collagen accumulation and the TGF-β1–mediated Slug–EMT switch in keratinocytes.


Matériaux et méthodes

Cell Culture.

MDA-MB-231 human breast cancer cells and MDA-MB-453 (American Type Culture Collection) were cultured in DMEM/Ham’s F-12 50/50 mix (Corning). SKBR-3 was cultured in McCoy’s 5A (modified) medium. The cell culture medium was further supplemented with 10% FBS (Atlanta Biologicals) as well as 1% penicillin-streptomycin (Corning). Cells were maintained at 37 °C in 5% CO2 until the time of experiment/fixation.

QRT-PCR Analysis.

mRNA for genetic analysis was extracted from MDA-MB-231 PGCCs and non-PGCCs using PureZOL RNA isolation reagent (Bio-Rad) according to the manufacturer’s recommendations. RNA integrity and purity were confirmed by spectrophotometry (Nanodrop 1000 Thermo Fisher Scientific). gDNA removal and cDNA synthesis were performed using the iScript gDNA Clear cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad) according to the manufacturer’s protocol. Here 1 μg of RNA was converted into cDNA for real-time PCR analysis of EMT markers. The primers used are listed in Annexe SI, Table S1.

Scratch Wound Assay.

MDA-MB-231 cells were seeded at high concentration and allowed to grow to 100% confluency in a 24-well plate (Corning) (Annexe SI, Fig. S2). The well plates were pretreated with 20 μg/mL type I rat tail collagen (Corning) for 1 h before seeding. Before imaging, confluent monolayers were scratched vertically and horizontally in a cross fashion with a 10-μL pipette tip. The well was then washed three times with PBS and fed using medium with Hoechst 33342 (1 μg/mL) for an additional 30 min. Hoechst-stained cells were then imaged with a Nikon Eclipse Ti inverted fluorescent microscope equipped with an environmental chamber (37 °C and 5% CO2). Edges of scratch wounds were selected and imaged periodically every 10 min for 12 h. Time-lapse videos were then exported, and individual images were fed into CellProfiler (Broad Institute). Using a custom pipeline, individual cells were identified within migrated regions. In brief, we used object segmentation after thresholding at 0 h to identify individual nuclei. Identified nuclei were then dilated to estimate the region of the initial monolayer (i.e., the initial coverage area). We repeated this process at different intervals to establish a time course, allowing us to determine the coverage ratio as well as to isolate migrated populations. PGCCs were subsequently identified by measuring the area of segmented nuclei.

Immunofluorescence Staining.

Cells designated for imaging at high magnification or by confocal microscopy were seeded in 24-well plates containing 12-mm, 1.5-μm-thick glass coverslips (Electron Microscopy Sciences). Scratch wounding in a cross formation was performed using a 10-μL pipette tip, and cells were allowed to migrate before fixation for predetermined times. Cells were fixed using 4% formaldehyde and 1% Triton X-100, then stained for DNA, actin, and vimentin cytoskeletal networks as described previously (1 ⇓ –3). In brief, a 1:100 dilution of anti-rabbit vimentin antibody (Cell Signaling Technology) was added to individual coverslips for 1 h. After incubation with primary antibody, coverslips were returned to well plates and then washed twice with PBS. Next, a 1:1,000 anti-rabbit Alexa Fluor 488 secondary antibody (Invitrogen) was used in conjunction with rhodamine-phalloidin (0.2 uM) and DAPI (5 ug/mL) for 1 h. Coverslips were washed three times with PBS and then mounted on microscope slides using Fluoromount-G (SouthernBiotech).

Images of the scratch wound were divided into migrated, unjammed, and jammed regions, defined as follows. The migrated region includes cells that have migrated and moved into the initial scratch area. The unjammed region represents cells located near the edge of the scratch wound, which are uncaged/unjammed by their neighbors and can migrate freely. Finally, the jammed region includes areas toward the middle of the monolayer, where cells are caged/jammed by their neighbors and cannot move freely. Images of fluorescently labeled cells were analyzed for vimentin polarity. In brief, the direction of cell migration was determined primarily by the position of the cell with respect to the scratch wound and overall cell morphology (i.e., identification of axis of elongation and lamellipodia structures). Vimentin polarity was then assessed with respect to the direction of cell migration (Annexe SI, Fig. S3).

Fluorescence Imaging and Volume Analysis.

Mounted slides were imaged using a Nikon Eclipse Ti inverted fluorescent microscope with a 60× objective or an Olympus 3000 confocal microscope (Z-stacks for 3D volume reconstructions). Les images de la microscopie confocale ont été analysées avec ImageJ à l'aide du plugin Voxel Counter après seuillage et fermeture de l'écart pour déterminer le volume cellulaire. En bref, des piles Z confocales d'actine colorée à la phalloïdine ont été seuillées par tranche, puis une fonction de fermeture d'espace a été utilisée pour combler les trous dans la zone seuillée (pour représenter la surface cellulaire par tranche). Enfin, le plugin Voxel Counter a été utilisé pour calculer le nombre de voxels inclus dans la zone seuillée, afin de mesurer le volume cellulaire global. Une approche similaire a été appliquée sur la vimentine colorée par fluorescence et les noyaux colorés par Hoechst, et le volume relatif vimentine/noyaux a été déterminé par rapport au volume total de la cellule. Les projections 3D ont été générées à l'aide de la fonctionnalité de visionneuse 3D aux Fidji.

Traitement siARN.

La vimentine MDA-MB-231 a été réduite au silence en utilisant un pool de trois duplex de siRNA obtenus à l'aide du kit TriFECTa DsiRNA pour la vimentine (Integrated DNA Technologies). Les cellules ont été transfectées avec chaque duplex ou avec des contrôles à l'aide de Lipofectamine-3000 (Invitrogen) selon les recommandations du fabricant. L'efficacité du Knockdown a été validée à l'aide de l'analyse de l'expression qRT-PCR des cellules transfectées avec le duplex de silençage par rapport au contrôle de brouillage fourni. L'absence d'effets hors cible a été confirmée en utilisant le duplex siRNA et en évaluant le niveau d'expression de HPRT1 (gène contrôle non ciblé par les duplex) par rapport à HPRT1 contrôle duplex renversant.