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8.11 : Clivage des protéines - Biologie

8.11 : Clivage des protéines - Biologie


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En raison de leur grande taille, les protéines intactes peuvent être difficiles à étudier à l'aide de techniques analytiques, telles que la spectrométrie de masse. Par conséquent, il est souvent souhaitable de décomposer un gros polypeptide en morceaux plus petits. Les protéases sont des enzymes qui rompent généralement les liaisons peptidiques en se liant à des séquences d'acides aminés spécifiques dans une protéine et en catalysant leur hydrolyse.

Des réactifs chimiques, tels que le bromure de cyanogène, qui clive les liaisons peptidiques du côté C-terminal d'un résidu méthionine, peuvent également être utilisés pour couper des protéines plus grosses en peptides plus petits. Les protéines courantes réalisant cette activité se trouvent dans le système digestif et sont présentées ci-dessous.

  • Subtilisine - Côté C-terminal des grandes chaînes latérales non chargées
  • Chymotrypsine - Côté C terminal des aromatiques (Phe, Tyr, Trp)
  • Trypsine - côté C-terminal de la lysine et des arginines (pas à côté de la proline)
  • Carboxypeptidase - Côté N-terminal de l'acide aminé C-terminal
  • Elastase - Hydrolyse le côté C des petits AA (Gly, Ala)
  • Bromure de cyanogène (chimique) - Hydrolyse le côté C du Met

Détermination de la masse et de la séquence protéique

La spectrométrie de masse, comme son nom l'indique, est une méthode qui peut être utilisée pour déterminer les masses de molécules. Autrefois limité à l'analyse de petites molécules, il a depuis été adapté et amélioré pour permettre l'analyse de molécules biologiquement importantes comme les protéines et les acides nucléiques. Les spectromètres de masse utilisent un champ électrique pour accélérer une molécule ionisée vers un détecteur. Le temps mis par une molécule ionisée pour se déplacer de son point d'ionisation au détecteur dépendra à la fois de sa masse et de sa charge et est appelé temps de vol (TOF).

MALDI-TOF

MALDI-TOF (Matrix-assisted Laser Desorption Ionization - Time of Flight) est une technique analytique permettant de déterminer les masses moléculaires de molécules biologiquement pertinentes avec une grande précision. Il est couramment utilisé en protéomique et en détermination de masses de grosses biomolécules, dont les acides nucléiques. Le développement de MALDI, qui permet la production de formes ioniques de molécules relativement grosses, a été crucial pour l'utilisation réussie de la spectrométrie de masse de biomolécules. La figure 8.46 montre un système MALDI-TOF compact.

Le processus MALDI-TOF comporte trois étapes de base. Tout d'abord, le matériau à analyser est noyé dans un matériau de support solide (matrice) qui peut être volatilisé dans une chambre à vide par un faisceau laser. Dans la deuxième partie du processus, un laser focalisé sur la matrice volatilise l'échantillon, provoquant la vaporisation des molécules qu'il contient et, ce faisant, la formation d'ions en gagnant ou en perdant des protons. Troisièmement, les ions ainsi créés dans l'échantillon sont accélérés par un champ électrique vers un détecteur. Leur vitesse de déplacement vers le détecteur est fonction du rapport de leur masse sur leur charge (m/z). Un ion avec une masse de 100 et une charge de +1 se déplacera deux fois plus vite qu'un ion avec une masse de 200 et une charge de +1 et à la même vitesse qu'un ion avec une masse de 200 et une charge de + 2. Ainsi, en déterminant avec précision le temps qu'il faut à un ion pour passer de l'ionisation (temps zéro du traitement laser) à la détection, le rapport masse sur charge de toutes les molécules d'un échantillon peut être facilement déterminé.

L'ionisation peut entraîner la déstabilisation de molécules plus grosses, qui se fragmentent en plus petites dans la chambre de détection MALDI-TOF. La taille de chacun des sous-fragments d'une molécule plus grosse permet de déterminer son identité si celle-ci n'est pas connue auparavant. Cette fragmentation peut être intentionnellement améliorée en faisant entrer les ions accélérés en collision avec un gaz inerte, comme l'argon.

La fragmentation d'une molécule peut également être effectuée avant l'analyse, comme par exemple en clivant une protéine en peptides plus petits par l'utilisation d'enzymes ou d'agents chimiques. La séquence d'acides aminés d'une protéine peut être déterminée en utilisant MALDI-TOF en analysant les masses moléculaires précises des nombreux fragments peptidiques courts obtenus à partir d'une protéine. Lorsqu'un acide aminé, par exemple, des fragments d'un peptide plus gros, cela peut être détecté comme la différence de masse entre le fragment avec et sans l'acide aminé, puisque chaque acide aminé aura une masse moléculaire caractéristique. Par empreinte de masse peptidique et analyse de fragments plus petits de peptides individuels, la séquence entière d'un polypeptide peut ainsi être déterminée.


Séquençage CUT&RUN

Séquençage CUT&RUN, aussi connu sous le nom clivage sous cibles et libération à l'aide d'une nucléase, est une méthode utilisée pour analyser les interactions des protéines avec l'ADN. Le séquençage CUT&RUN combine un clivage contrôlé ciblé sur les anticorps par la nucléase micrococcale avec un séquençage massivement parallèle de l'ADN pour identifier les sites de liaison des protéines associées à l'ADN. Il peut être utilisé pour cartographier les sites mondiaux de liaison à l'ADN avec précision pour toute protéine d'intérêt. Actuellement, ChIP-Seq est la technique la plus couramment utilisée pour étudier les relations protéine-ADN, cependant, elle souffre d'un certain nombre de limitations pratiques et économiques que le séquençage CUT&RUN n'a pas.


Intégration de la signalisation immunitaire innée par clivage caspase-8 de N4BP1

Des mutations dans le récepteur de la mort FAS 1,2 ou son ligand FASL 3 provoquent un syndrome lymphoprolifératif auto-immun, tandis que des mutations dans la caspase-8 ou son adaptateur FADD - qui médient la mort cellulaire en aval du FAS et du FASL - provoquent une immunodéficience sévère en plus du syndrome lymphoprolifératif auto-immun 4 -6 . Les modèles murins ont corroboré un rôle pour FADD-caspase-8 dans la promotion des réponses inflammatoires 7-12, mais les mécanismes qui sous-tendent l'immunodéficience restent indéfinis. Ici, nous identifions NEDD4-binding protein 1 (N4BP1) comme un suppresseur de la production de cytokines qui est clivée et inactivée par la caspase-8. La délétion de N4BP1 chez la souris a augmenté la production de cytokines sélectionnées lors de la stimulation de l'hétérodimère Toll-like receptor (TLR)1-TLR2 (appelé ici TLR1/2), TLR7 ou TLR9, mais pas lors de l'engagement de TLR3 ou TLR4. N4BP1 n'a pas supprimé les réponses TLR3 ou TLR4 dans les macrophages de type sauvage, en raison du clivage TRIF- et dépendant de la caspase-8 de N4BP1. Notamment, la production altérée de cytokines en réponse à la stimulation par TLR3 et TLR4 des macrophages 13 déficients en caspase-8 a été largement sauvée par la co-délétion de N4BP1. Ainsi, la persistance de N4BP1 intact dans les macrophages déficients en caspase-8 altère leur capacité à monter des réponses cytokines robustes. Le facteur de nécrose tumorale (TNF), comme les agonistes de TLR3 ou TLR4, a également induit un clivage de N4BP1 dépendant de la caspase-8, autorisant ainsi les TLR indépendants de TRIF à produire des niveaux plus élevés de cytokines inflammatoires. Collectivement, nos résultats identifient N4BP1 comme un puissant suppresseur de réponses cytokiniques, révèlent le clivage de N4BP1 par la caspase-8 comme point d'intégration du signal pendant l'inflammation et offrent une explication de l'immunodéficience causée par des mutations de FADD et de caspase-8.


Architecture protéique commune et sites de liaison dans les protéases utilisant un mécanisme de dyade Ser/Lys.

La peptidase signal d'Escherichia coli (SPase) et la protéase UmuD d'E. coli sont membres d'un clan évolutif de protéases à sérine qui utilisent apparemment un mécanisme de dyade catalytique sérine-lysine. Récemment, la structure cristallographique d'un complexe inhibiteur de la SPase a été résolue en élucidant les résidus catalytiques et les sous-sites de liaison au substrat. Ici, nous montrons une comparaison détaillée de la structure E. coli SPase à la structure native E. coli UmuD'. La comparaison révèle que malgré une très faible identité de séquence, ces enzymes fonctionnellement diverses partagent le même repli protéique dans leur noyau catalytique et permet par analogie l'attribution de l'orientation du site de clivage et des sous-sites de liaison au substrat dans la protéase UmuD(D'). L'alignement structurel de la SPase et de l'UmuD' prédit d'importantes similitudes et différences mécaniques et structurelles au sein de ces familles nouvellement caractérisées de protéases à sérine.


Résumé

Bien que la sclérose en plaques (SEP) soit considérée comme une maladie auto-immune, les mécanismes par lesquels les épitopes immunodominants sont générés et les lymphocytes activés ne sont pas connus. Ici, il a été démontré que le composant 1 de la protéine basique de la myéline (MBP-C1) du tissu MS subit un clivage autocatalytique à un pH légèrement alcalin. Fait important, l'un des principaux peptides libérés contenait l'épitope immunodominant 84-89. Fait intéressant, la MBP isolée de patients atteints de SEP a montré une évolution plus rapide du clivage et une libération plus robuste de l'épitope 84-89 que la MBP isolée d'individus normaux. La réaction de clivage n'a pas été inhibée par les inhibiteurs de protéase, à l'exception du fluorure de phénylméthanesulfonyle (PMSF), un inhibiteur de protéase à sérine. Étant donné que l'inhibition de PMSF a suggéré un rôle pour un résidu sérine dans le clivage, nous avons marqué la protéine basique de la myéline avec du fluorophosphate de diisopropyle (DFP), connu pour se lier aux résidus sérine du site actif. La spectrométrie de masse a été utilisée pour identifier le peptide marqué, qui se composait des résidus 140-152. Puisque ce peptide contenait un seul résidu sérine, nous avons conclu qu'il s'agissait de la sérine active. L'importance de ce mécanisme de clivage est qu'il fournit une source prête du peptide immunodominant pour la sensibilisation des lymphocytes T. Il n'est pas nécessaire d'invoquer d'autres mécanismes tels que le mimétisme moléculaire.

Ce travail a été soutenu par des subventions des Instituts de recherche en santé du Canada et de la Société canadienne de la sclérose en plaques à M.A.M. Financement partiel par la Société canadienne de la SP par le biais d'une bourse d'études à C.A.D. est apprécié.

A qui la correspondance doit être adressée. Tél. : 416-813-5920. Télécopieur : 416-813-5022. Courriel : [e-mail protected]


8.11 : Clivage des protéines - Biologie

Les coronavirus félins (FCoV) existent sous 2 biotypes : le coronavirus entérique félin (FECV) et le virus de la péritonite infectieuse féline (FIPV). Le FeCV provoque des infections subcliniques Le FIPV provoque une péritonite infectieuse féline (PIF), une maladie systémique et mortelle. On pense que des mutations dans le FeCV permettent l'infection des macrophages, provoquant la PIF. Cependant, la base moléculaire de ce changement de biotype est inconnue. Nous avons examiné un site de clivage de la furine dans la région entre les domaines de liaison au récepteur (S1) et de fusion (S2) du pic de sérotype 1 FCoV. Les séquences du FeCV ont été comparées aux séquences du FIPV. Tous les FECV avaient un motif de clivage de la furine conservé. Pour FIPV, il y avait une corrélation avec la maladie et la substitution > 1 dans le motif S1/S2. Les dosages de peptides fluorogènes ont confirmé que les substitutions modulent le clivage de la furine. Nous documentons une mutation S1/S2 fonctionnellement pertinente qui survient lorsque la PIF se développe chez un chat. Ces informations sur la pathogenèse de la PIF peuvent être utiles dans le développement de mesures de diagnostic, de prévention et de traitement contre les coronavirus.

La péritonite infectieuse féline (PIF) est une infection mortelle qui affecte les membres domestiques et sauvages de la famille Felidae et est causée par un coronavirus félin (FCoV) de la famille Coronaviridae, sous-famille Coronavirinae, genre Alphacoronavirus, espèces Alphacoronavirus-1 (1). Le génome du FCoV est 29 kB et possède 11 cadres de lecture ouverts codant pour des protéines réplicatives, structurelles et accessoires (2). Deux sérotypes ont été identifiés. Les FCoV de sérotype 1 sont très répandus sur le plan clinique (35) mais se développent mal en culture cellulaire et sont donc sous-évalués par rapport aux FCoV de sérotype 2, qui se propagent facilement in vitro mais moins répandus.

Au sein de chaque sérotype, il existe 2 biotypes, chacun provoquant des résultats distincts de la maladie. Le coronavirus entérique félin (FECV) des sérotypes 1 et 2 infecte les entérocytes, provoquant des infections bénignes et généralement spontanément résolutives. Le FeCV se propage efficacement par voie orale-fécale, et les chats chroniquement infectés peuvent excréter le virus infectieux dans les selles pendant un an ou plus (6,7). Le deuxième biotype trouvé dans les deux sérotypes, le virus FIP (FIPV) est moins fréquent mais cause la PIF.

La compréhension actuelle est que le FIPV survient au cours d'une infection in vivo à partir d'une mutation génétique du FeCV (811). Une hypothèse de longue date est que les virus FIP résultent d'une mutation interne des FeCV endémiques (12), qui se produirait dans environ 1 % à 5 % des infections entériques, entraînant la capacité du virus à infecter les monocytes sanguins et les macrophages tissulaires. L'infection productive résultante de ces cellules, une caractéristique de la PIF, permet une propagation systémique et entraîne l'activation des macrophages, avec des événements concomitants à médiation immunitaire conduisant à la mort. À ce jour, la ou les mutations précises qui provoquent un changement dans le biotype du FCoV n'ont pas été identifiées.

Comme avec d'autres virus à ARN, la réplication du coronavirus est sujette aux erreurs, le taux de mutation estimé est ≈4 × 10 -4 substitutions de nucléotides/site/an (13,14). Il a été suggéré que des mutations dans les gènes 3c et 7b pourraient être impliquées dans la transition vers le FIPV (1,12,15). Étant donné que la protéine de pointe FCoV joue un rôle essentiel dans la liaison au récepteur (S1) et la fusion (S2), nous nous sommes concentrés sur les changements structurels de cette protéine et son rôle potentiel dans le tropisme cellulaire altéré. En particulier, l'acquisition du tropisme des macrophages pour un FCoV de sérotype 2 a déjà été mappée sur le gène spike (16), suggérant en outre que des mutations clés au sein de la protéine de pointe peuvent être importantes pour le changement de biotype.

La protéine de pointe du coronavirus est une protéine de fusion de classe I, qui nécessite généralement une activation par des protéases cellulaires. La mutation du site de clivage protéolytique a souvent des implications profondes pour la progression de la maladie (17,18). Jusqu'à récemment, on pensait que les FCoV avaient une protéine de pointe non clivée. Cependant, un site de clivage fonctionnel de la furine a été identifié dans 2 FECV de sérotype 1, situés à la limite commune des sous-unités S1 et S2 (19). La furine est une proprotéine convertase omniprésente enrichie dans le réseau trans-Golgi et bien conservée chez les mammifères (20). La furine clive une large gamme de précurseurs de protéines en produits biologiquement actifs au niveau d'un motif consensus R-X-K/R-R, où R est le résidu basique d'arginine, X est n'importe quel résidu et K est le résidu basique de lysine (21).

Dans cet article, nous établissons une nouvelle approche pour étudier la FIP qui complète les travaux antérieurs. Au lieu d'effectuer une étude de mutation basée principalement sur une analyse génétique comparative (15,2224), nous nous concentrons sur S1/S2, un site fonctionnellement pertinent, et étudions les variations entre les biotypes et leurs effets fonctionnels. Cette justification pourrait fournir un meilleur moyen de découvrir des mutations fonctionnellement importantes qui expliquent la PIF.

Nous avons considéré que des mutations au site S1/S2 pourraient altérer le clivage protéolytique et modifier les propriétés fusogènes de S, entraînant une expansion du tropisme, une propagation systémique et, finalement, une PIF. Nous avons étudié les variations génétiques au site S1/S2 des FeCV de sérotype 1 et comparé ces séquences à celles présentes dans l'ARN viral récupéré à partir de tissus de chats atteints de PIF. Des essais de clivage de peptides fluorogènes ont été effectués pour évaluer les effets des substitutions trouvées dans le site S1/S2. Nous documentons une mutation de jonction à S1/S2 qui survient au cours du développement de la PIF. Notre étude a découvert une base moléculaire pour la PIF qui a le potentiel de conduire à des développements dans le diagnostic, la prévention et les thérapies.

Matériaux et méthodes

Analyse de séquence FCoV

Les données cliniques et démographiques sont rapportées dans le tableau 1 de l'annexe technique. Des échantillons fécaux de chats domestiques infectés asymptomatiques ont été sollicités auprès de refuges et de vétérinaires à travers les États-Unis. L'ARN a été extrait en utilisant le kit QIAamp Viral RNA Mini (QIAGEN, Valencia, CA, USA). Des amorces FCoV qui détectent la plupart des souches circulantes ont été utilisées pour cribler tous les échantillons fécaux (25). L'ARN extrait de la souche adaptée au laboratoire FIPV-TN406 (Black) a été utilisé comme témoin positif.

Nous avons analysé 22 échantillons de tissus FIPV-positifs (Veterinary Pathology Archives, Cornell University, Ithacan, NY, USA) provenant de 11 chats atteints de PIF. Le diagnostic de la PIF était basé sur la méthode standard d'évaluation immunohistochimique par des pathologistes certifiés. Chaque échantillon a été récupéré à partir de blocs de tissus fixés au formol et inclus en paraffine dont les sections ont été colorées en utilisant l'anticorps FIPV 3-70 (Custom Monoclonals, Sacramento, CA, USA). Les régions colorées positivement ont été finement coupées et l'ARN a été extrait en utilisant RecoverAll (Ambion, Foster City, CA, USA).

Les échantillons fécaux collectés auprès de colocataires positifs au FCoV, les chats 234 et 304, ont été traités comme décrit précédemment dans cette section. Après que le vétérinaire référent ait posé un diagnostic de PIF chez le chat 234, le propriétaire a choisi d'euthanasier l'animal. Du tissu frais a été récolté et l'ARN extrait en utilisant MagMAX Express (Life Technologies, Grand Island, NY, USA).

Pour tous les échantillons, 50 L de PCR de transcription inverse (RT-PCR) ont été effectués avec une RT-PCR en une étape (QIAGEN) en utilisant des amorces S spécifiques du gène, englobant S1/S2. Les séquences des amorces de PCR se trouvent dans le tableau 2 de l'annexe technique. Les conditions de PCR étaient de 30 min à 50 °C, 15 min à 95 °C et 39 ou 35 cycles de 1 min à 94 °C, 1 min à 55 °C, 1 ou 1,5 min à 72°C, et 10 min à 72°C. Les produits de PCR ont été purifiés en utilisant un kit d'extraction de gel QIAquick (QIAGEN). Le séquençage de Sanger a été réalisé au Life Sciences Core Laboratories (Cornell University). Les numéros d'accession des archives de nucléotides sont indiqués dans le tableau 4 de l'annexe technique. Les séquences d'ADN ont été traduites en séquences de protéines et les alignements ont été effectués en utilisant Geneious 5.4 (Biomatters Ltd., Auckland, Nouvelle-Zélande). Les logos de séquence ont été générés à l'aide de Weblogo 3.1 (http://weblogo.threeplusone.com/). L'analyse statistique a été réalisée en utilisant le test exact de Fischer bilatéral. Dans le test, le nombre de chats infectés par le FIPV et le FeCV a été compté. Pour chaque catégorie d'infection FIPV ou FeCV, les chats hébergeant des virus avec ou sans mutations au site S1/S2 ont été comptés.

Clivage Furin A

Des peptides fluorogènes 12-mères ont été conçus et synthétisés par RS Synthesis, Louisville, KS, USA (Annexe technique Tableau 3). La furine humaine recombinante purifiée a été achetée auprès de NEB (Ipswich, MA, USA). Pour chaque réaction, 1 unité d'enzyme a été utilisée dans 100 L de volume final en utilisant le tampon de réaction 100 nmol/L HEPES, 0,5% Triton X-100, 1 mmol/L CaCl2, 1 mmol/L de 2-mercaptoéthanol, pH 7,5. Les peptides ont été dilués à 50 mmol/L. Les réactions ont été réalisées en triple à 30°C et la fluorescence a été mesurée avec un fluoromètre SpectraMax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA), permettant la détermination de Vmax. Les résultats pour chaque peptide sont exprimés en pourcentage de clivage par la furine par rapport à la séquence canonique.

Pour effectuer une analyse comparative du site de clivage S1/S2 entre les FeCV et les FIPV, nous avons identifié des cas de PIF qui ont été confirmés post-mortem en utilisant l'immunohistochimie, la norme pour le diagnostic de la FIP. . Pour garantir une bonne qualité des informations de séquence à partir du matériel d'archives, la taille de l'amplicon RT-PCR a été limitée à 160 pb (y compris le site S1/S2). Cette même région a ensuite été amplifiée à partir de matières fécales de chats sains positifs pour le coronavirus.

Résultats

FECV S1/S2

Figure 1. . Analyse de séquence du site S1/S2 du pic du coronavirus entérique félin (FECV).L'ARN de 30 FeCV collectés à partir de 30 échantillons fécaux provenant de chats infectés de manière subclinique a été extrait, purifié et rétro-transcrit.

Figure 2. . Analyse de séquence du site S1/S2 du pic du virus de la péritonite infectieuse féline (FIPV). L'ARN de 22 FIPV prélevés sur 11 chats atteints de péritonite infectieuse féline a été extrait, purifié et rétro-transcrit.

Le séquençage du site S1/S2 de séquences 30 S à partir d'échantillons fécaux de FeCV a révélé un motif extrêmement bien conservé au niveau des acides aminés (figure 1, panneau A). En particulier, les résidus d'arginine (R) se trouvent exclusivement aux positions les plus critiques pour la reconnaissance et le clivage de la furine (P1, P2 et P4) dans toutes les séquences analysées (Figure 2, panneau B). La position P1′ est extrêmement bien conservée, car la sérine (S) est retrouvée dans 100% des cas. La position P5 est également bien conservée, mise en évidence par une nette majorité de résidus basiques trouvés (96,6 % d'arginine ou de lysine [K] Figure 2, panneau B). A P3, une variabilité limitée est retrouvée (76,7 % de sérine et 23,3 % d'alanine [A]). Globalement, 100 % des séquences de FeCV analysées contiennent le site de clivage de la furine, avec un motif central de R-R-S/A-R-R-S.

FIPV S1/S2

Figure 3. . Fréquence de substitution des acides aminés à chaque position du site de clivage S1/S2 du virus de la péritonite infectieuse féline. L'histogramme est basé sur l'analyse du virus de la péritonite infectieuse féline S1/S2 WebLogo 3.1 (<>

L'analyse du site de clivage S1/S2 des séquences FIPV montre qu'il a beaucoup plus de variabilité, à la fois au sein du motif de reconnaissance de clivage de la furine étroite (P4-P1) et dans les résidus s'étendant hors de celui-ci (P8-P5 et P2′-P4′) (Figure 2A). Une observation frappante est que les positions critiques P1 et P2 sont parmi les plus régulièrement mutées (Figure 3). Dans une moindre mesure, la variabilité s'étend à d'autres positions du motif de clivage, notamment dans les positions P1′, P3, P4 et P5 (Figure 2). Les résultats de l'examen de toute la partie du pic séquencé dans cette étude indiquent que le motif RRS/ARRS conservé dans le FECV est présent dans une région du gène du pic qui montre un degré élevé de variabilité, contrairement à d'autres régions voisines qui sont plus hautement conservées. (Annexe technique Figure 1).

Corrélation entre le statut FIP ​​des chats et la présence de mutations à S1/S2
Essai de clivage du peptide fluorogène furine

Graphique 4. . Essais de clivage de la furine de peptides fluorogènes. A) Des peptides fluorogènes synthétiques ont été générés avec des séquences correspondant au coronavirus entérique félin consensus et à un panel de séquences modifiées avec des substitutions (indiquées en rouge).

Pour tester si les mutations FIPV S1/S2 identifiées ont un effet sur la clivabilité par la furine, nous avons effectué un test protéolytique in vitro. Nous avons utilisé de la furine humaine pour ces expériences. La furine humaine et féline sont très similaires (identiques à 96 %) et devraient se scinder de manière équivalente. Cependant, la furine féline n'a pas été directement étudiée à un degré quelconque, et les réactifs ne sont pas facilement disponibles. Les lignées cellulaires félines et humaines présentent des taux de clivage identiques pour une protéine cible connue de la furine (PSCK-9), qui contient un site de clivage actif de la furine (annexe technique, figure 2). Nous avons utilisé des peptides fluorogènes contenant le motif canonique (R-R-S-R-R-S) ou avec des substitutions des positions P1′ à P7 (Figure 4, panneau A). Le peptide canonique a été efficacement clivé par la furine (figure 4), avec une Vmax moyenne de 235 unités de fluorescence relative (RFU) par minute.

Au sein du peptide central P4-P1′, dans le fond canonique, lorsque le résidu sérine P1′ est transformé en leucine (L), le clivage de la furine est fortement diminué (8% du taux de clivage canonique), un résultat qui montre le rôle clé de la sérine P1′ conservée. Les modifications de l'arginine P1 dans le peptide canonique, quel que soit le résidu testé, par exemple la glycine (G), la méthionine (M) ou la thréonine (T), abrogent le clivage par la furine (Figure 4). Les modifications au niveau du résidu arginine P2 dans le peptide canonique ont des effets variables. Lorsque l'arginine P2 est changée en histidine (H), il y a inhibition complète (0% de clivage canonique). Lorsque P2 est remplacé par de la leucine ou de la sérine, l'efficacité du clivage est réduite d'environ 50 % et 20 %, respectivement. Lorsque P2 est modifié en proline (P), l'efficacité de clivage augmente légèrement jusqu'à 129% du peptide canonique (figure 4). La substitution P3 S-A améliore de façon minimale le clivage (figure 4). L'arginine P4 est une autre position de résidu qui est essentielle pour le clivage de la furine. Dans le peptide canonique, substitution P4 R-K, il y a une légère diminution de l'efficacité de clivage (88,7 % du taux canonique). En revanche, lorsque l'arginine P4 est remplacée par de la glycine, le clivage de la furine est complètement abrogé (figure 4).

Pour les positions en amont de P4, alors que les modifications P5 RK et P6 TF ont des effets d'amélioration modérés sur le clivage de la furine (respectivement 149% et 162% du taux canonique), le peptide P7 HQ montre une augmentation substantielle de sa clivabilité (186 % par rapport au taux canonique). ). Le peptide P7 H-Q P5 R-K montre que l'effet de chaque modification peut être additif (232 % par rapport au peptide canonique) (Figure 4).

Mutation S1/S2 fonctionnellement pertinente

Pour confirmer davantage nos résultats, nous avons analysé les sites S1/S2 à partir d'échantillons viraux prélevés sur les chats 234 et 304, qui vivaient dans le même foyer (tableau 2). Lors de l'échantillonnage initial en 2009 (t = 1), les deux chats étaient asymptomatiques pour la PIF et excrétaient du FCoV dans leurs selles. Dans les échantillons des deux chats, les sites S1/S2 avaient une séquence centrale R-R-S-R-R-S cohérente avec le consensus du FeCV. Lors du deuxième échantillonnage en 2011/2012 (t = 2), la PIF a été diagnostiquée chez le chat 234. Le chat 304 est resté asymptomatique mais a continué à excréter le virus dans les selles. Notamment, lorsque les séquences S1/S2 ont été analysées lors du deuxième échantillonnage, seul le chat avec FIP (234) avait un changement dans la séquence consensus du FeCV (une mutation P2 R-L). Tout en présentant un changement dans le résidu P3 (S-A), le virus présent dans le chat 304 a conservé le motif de clivage de la furine S1/S2 conservé (tableau 2). Ces données fournissent des preuves directes de mutations du pic liées au développement de la PIF chez le chat.

Discussion

Pour étudier la PIF, nous avons adopté une approche alternative qui complète les études antérieures basées sur les résultats analytiques des mutations putatives causant la PIF et l'inférence de leurs conséquences fonctionnelles. Nous nous sommes concentrés sur la séquence S1/S2, un site de clivage spécifique et hautement pertinent au sein de la protéine S, et avons documenté les mutations entre les chats asymptomatiques et hautement symptomatiques qui étaient fortement corrélées avec la PIF. Nous avons également documenté une mutation fonctionnelle du site de clivage S1/S2 qui est survenue chez un chat asymptomatique qui a par la suite développé une PIF.

Nos données de séquence montrent que le FeCV de sérotype 1 provenant des matières fécales de chats asymptomatiques contient un motif de clivage de la furine hautement conservé sur le site S1/S2, avec la plage étroite de résidus suivante : (R>>K/G) P5 -(R) P4 -(S>A) P3 -(R) P2 -(R) P1 -(S) P1' . En plus du motif consensus R-X-K/R-R, des résidus flanquants supplémentaires peuvent également être consécutifs au clivage induit par la furine (2628). En particulier, un résidu sérine (S) est critique en position P1′ (29) et il est à noter que tous les FeCV examinés contenaient un résidu P1′ S. Le fait que le site S1/S2 soit extrêmement bien conservé est une indication qu'il est fonctionnellement essentiel pour la réplication du FeCV dans l'épithélium entérique.

Contrairement à la situation des chats asymptomatiques infectés par le FeCV, nous avons constaté que les séquences de FCoV échantillonnées à partir de tissus de chats FIP-positifs confirmés présentaient systématiquement des mutations au site S1/S2. Dans la position la plus critique pour le clivage de la furine, P1, nous avons constaté que > 40% des FIPV ont une mutation dans le résidu arginine, qui est remplacé par un résidu aliphatique (méthionine et glycine) ou polaire non chargé (thréonine). Dans l'ensemble, la caractéristique distinctive des FIPV est l'absence de l'arginine P1, plutôt que la présence d'un résidu particulier. Ceci est corroboré par nos données de clivage peptidique qui démontrent que le clivage de la furine est entièrement abrogé pour toutes les substitutions P1 testées. La prochaine position la plus courante mutée dans FIPV est P2 >30% des FIPV analysés portaient des mutations à cette position. La plupart des résidus mutés trouvés étaient aliphatiques (P et L). Certaines séquences ont été substituées par un résidu polaire basique (H) ou un résidu polaire non chargé (S). En dehors de la substitution P2 R-P, les données de clivage peptidique indiquent que toutes les autres substitutions ont un effet inhibiteur sur le clivage de la furine. Il est à noter que pour le virus de l'hépatite murine (MHV), un bêtacoronavirus qui héberge également un site de clivage S1/S2 dans sa protéine de pointe, il existe un précédent pour l'effet inhibiteur de l'introduction d'une histidine en position P2 du site de clivage. Deux souches bien étudiées, la souche MHV A59 (MHV-A59) et la souche neurovirulente MHV JHM (MHV-JHM), présentent une différence notable sur ce site. MHV-A59 a une séquence R-R-S-H-R-S et est moins efficacement clivé que MHV-JHM, qui a une séquence R-R-A-S-S-R (18). P4 est généralement considéré comme critique pour le clivage de la furine, mais nous avons trouvé une variation limitée dans cette position de résidu pour les FIPV testés et avons trouvé une mutation vers le résidu polaire basique (K) ou le résidu polaire non chargé (S) dans <5% des virus. Les données peptidiques indiquent que, bien que l'introduction d'une sérine en P4 annule complètement le clivage, la substitution P4 R→K a un effet minimal. La position FIPV P3 a montré une faible variation par rapport au FeCV après l'introduction d'un résidu polaire non chargé (T) dans 1 échantillon. Pour la position P5, le seul changement était une fréquence légèrement plus élevée du résidu de lysine dans les échantillons de chats atteints de FIPV. Les données de clivage peptidique ont indiqué que la substitution S-A commune trouvée pour les positions du FeCV et du FIPV P3 n'a que légèrement augmenté l'effet sur la protéolyse par la furine. De plus, la substitution P5 R→K a un effet d'amélioration dans le test de clivage peptidique. À P1′, le résidu non chargé polaire conservé (S) a été retenu dans la majorité des échantillons FIPV, cependant, l'introduction d'un acide aminé aliphatique (L) a été trouvée. Il est à noter que le clivage de la furine a été suggéré comme étant incompatible avec une chaîne latérale aliphatique hydrophobe, avec une forte préférence pour la sérine en position P1′ (27,29). Dans l'échantillon D04-397-2 contenant le P1′ L, les résidus basiques dans le site S1/S2 restent identiques à ceux trouvés dans la séquence du FeCV, nous suggérons que la perturbation du clivage de la furine est médiée par une mutation dans P1′, plutôt que la mutation P1, P2 et/ou P4 plus typique. Cette hypothèse est étayée par le test de clivage peptidique, où le peptide P1′S-L est incapable d'être clivé par la furine.

Dans l'ensemble, en termes d'animaux positifs pour la FIP, nous avons constaté que 10 des 11 chats hébergeaient des virus avec des mutations dans le motif furine R-R-S/A-R-R-S trouvés dans le FeCV des chats asymptomatiques. Pour la plupart des chats positifs à la FIP, nous avons séquencé l'ARN viral prélevé dans différents tissus (tableau 1 de l'annexe technique). Nos données soutiennent fortement l'hypothèse de la mutation interne, car les mutations sont uniques à chaque chat.

Il est à noter que tous les tissus du même animal ne portent pas la même mutation. Dans certains cas, des populations mixtes de virus existent au sein du même animal. La majorité des virus séquencés avaient 1 mutation, bien que 5 (D06-244-1, D06-244-2, 08-153990-2, N07-95-1 et D04-93-2) aient eu 2 mutations. Cependant, il existe 2 exceptions apparentes de chats hébergeant des virus qui n'ont pas de mutations clairement définies dans le site de clivage de la furine : échantillons du chat 151643 (13) et des échantillons du chat N05-110 (1,2). Nous considérons que la présence d'un clivage de la furine P6 dans les échantillons du chat 151643 est cohérente avec notre hypothèse d'un changement de la protéase activatrice pour le virus, car ce n'est pas typique des sites de clivage de la furine naturels. Les échantillons 1 et 2 du chat N05-110 hébergent un virus avec un résidu de lysine atypique à P5. Bien qu'inhabituel pour les FeCV, un résidu de lysine P5 semble être compatible avec le clivage de la furine. corrélée avec FIPV dans le cas de ce chat.

Dans le cadre de notre étude, nous avons analysé des échantillons de terrain provenant de chats porteurs de FCoV à différents moments. Chez le chat 234, le virus a subi une transition du FeCV au FIPV et présentait une mutation fonctionnellement pertinente dans le motif S1/S2 (P2 R-L). Le chat 304, vivant dans la même maison que le chat 234, est resté asymptomatique. Le chat 304 abritait un virus muté, mais la mutation était dans une position fonctionnellement non pertinente (P3 S-A). L'identification des chats atteints du FeCV chez lesquels la PIF se développe par la suite est difficile, et bien que nous présentions un seul exemple, nous considérons ces données comme une preuve solide que les mutations au site S1/S2 sont liées à un changement des propriétés pathogènes du virus, et susceptible d'être essentiel pour l'acquisition du tropisme des macrophages observé dans la PIF.

Le site de clivage S1/S2 et les résidus environnants des séquences FIPV S de sérotype 1 se sont avérés systématiquement modifiés par des mutations. Chang et al. a récemment publié une analyse comparative approfondie des mutations FIP au niveau des nucléotides en effectuant un séquençage du génome entier des FeCV et des FIPV. FIPV (15). Nous avons entrepris une analyse des sites S1/S2 séquencés par Chang et al. et constatent que notre hypothèse selon laquelle la mutation au sein du motif furine S1/S2 est en corrélation avec la FIP dans ≈64 % de leurs échantillons. Il existe 3 différences méthodologiques qui peuvent expliquer ce manque d'accord : tout d'abord, nous avons utilisé l'immunohistochimie pour confirmer le diagnostic de PIF, tandis que Chang et al. rapportés en utilisant l'examen post mortem en second lieu, tous les échantillons de PIF dans cette étude proviennent de tissus, tandis que Chang et al. inclus à la fois des tissus et du liquide d'ascite et enfin, nous rapportons plusieurs séquences pour les chats atteints de PIF, tandis que Chang et al. rapporté une seule séquence. Les données de séquence des échantillons D04-397-1 et D04-397-2 fournissent la preuve que les populations de FeCV et de FIPV peuvent être identifiées chez un animal affecté. Les informations de séquence provenant d'un seul échantillon peuvent ne pas être adéquates pour la détection d'un virus muté.

La plupart des mutations affectent négativement le traitement de la furine, mais certaines l'améliorent. Étant donné que la majorité des protéines FIPV S contiennent encore des résidus basiques à la limite S1/S2, on pourrait penser que le site muté devient plus ouvert et peut être clivé par une gamme d'autres protéases. Le changement des exigences protéolytiques de S que nous proposons peut offrir une explication pour la transition cruciale du tropisme au cours de la PIF. Une conséquence possible des mutations est la clivabilité par des protéases spécifiques des monocytaires/macrophages. Il peut s'agir de pro-protéines convertases, de cathepsines ou d'autres protéases spécifiques des macrophages. En particulier, la cathepsine B, les métalloprotéases matricielles et la PCSK1 liée à la furine sont susceptibles d'être exprimées à la surface des macrophages et de reconnaître les résidus caractéristiques restants ou acquis dans le site de clivage FIPV S1/S2 (30). La métalloprotéase matricielle 9 est particulièrement intéressante car il a été démontré qu'elle est régulée à la hausse dans les monocytes et les macrophages activés pendant la PIF (31). Un changement dans la voie d'entrée pour permettre l'entrée du virus à la surface cellulaire au lieu de l'endosome peut expliquer simultanément la capacité du FIPV à infecter les macrophages et la résistance aux macrophages du FeCV. Il est également possible que les mutations dans la région S1/S2 affectent le site de liaison du sulfate d'héparine dans cette région (19). Cependant, la liaison au sulfate d'héparine est une adaptation du virus à la culture cellulaire et, par conséquent, sa pertinence par rapport à la situation clinique semble peu probable.

Un point de vue opposé à l'hypothèse de la mutation interne pour expliquer la genèse des épidémies de PIF est qu'il existe un FCOV circulant autre que le FeCV qui est spécifique de la PIF (22). Pour un processus pathologique complexe tel que la PIF, nous et d'autres considérons qu'il peut y avoir des FeCV circulants qui sont plus proches de faire les mutations critiques nécessaires à la PIF, expliquant peut-être des épidémies paradoxales de PIF (32). Sur la base des données que nous présentons ici, nous concluons que la mutation du locus S1/S2 et la modulation d'un site de reconnaissance de la furine normalement présent dans le gène S des FeCV est un facteur critique pour le développement de la PIF. D'autres études pourraient servir à analyser comment les mutations S1/S2 correspondent aux autres mutations avancées pour expliquer le développement de la PIF.

Mme Licitra est une étudiante diplômée en double diplôme (DVM/PhD) au Whittaker Laboratory, dans le département de microbiologie et d'immunologie, College of Veterinary Medicine, Cornell University, Ithaca, NY, USA. Ses intérêts de recherche incluent les maladies zoonotiques et à transmission vectorielle et la pathogenèse microbienne.

Remerciements

Les auteurs remercient Meredith Brown, Stephen O'Brien, Sean McDonough et Edward Dubovi pour avoir fourni certains des échantillons cliniques utilisés dans cette étude et Nadia Chapman et Wendy Wingate pour leur assistance technique. Nous remercions Nabil Seidah pour ses conseils et ses commentaires utiles et pour la fourniture des réactifs PSCK-9 et Sara Sawyer pour ses commentaires utiles. Nous tenons également à remercier Jing Yang pour son aide dans l'analyse statistique.

Cette recherche a été financée par des subventions du Cornell Feline Health Center, de la Winn Feline Health Foundation et de la Morris Animal Foundation. A.D.R. a été soutenu par la subvention T32AI007618 (Formation en virologie moléculaire et pathogenèse) des National Institutes of Health. Les sponsors n'avaient aucune influence sur la conception de l'étude, la collecte, l'analyse et l'interprétation des données, la rédaction du manuscrit ou la décision de soumettre le manuscrit pour publication. Tous les travaux ont été approuvés par l'Institutional Animal Use and Care Committee de l'Université Cornell (Ithaca, NY).

Les références

Les figures
Les tables

1 Ces auteurs ont contribué à parts égales à cet article.

Veuillez utiliser le formulaire ci-dessous pour envoyer une correspondance aux auteurs ou les contacter à l'adresse suivante :

Gary Whittaker, Département de microbiologie et d'immunologie, Université Cornell, Ithaca, NY 14853, États-Unis

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RÉSULTATS

Sur la validité de la vidéodensitométrie

Dans certaines limites expérimentales (principalement la saturation du colorant ou l'appauvrissement en argent), la lumière transmise par les gels de polyacrylamide colorés ou leurs autoradiogrammes ou fluorogrammes correspondants obéit à la loi classique de Lambert/Beer, à savoir que l'absorbance, ou DO, est directement proportionnelle à la longueur du chemin optique. (qui est constante) et la concentration (quantité de colorant ou densité des grains d'argent). Dans le cas des immunoblots, la lumière réfléchie par un spot (comme la lumière transmise par des bandes de gel ou de film) dépend inversement de la lumière absorbée, étant donné que trop de produit opaque ne s'accumule pas. L'absorbance (ou réflectance) est un Journal fonction, journal (intensité incidente/intensité transmise ou réfléchie), tandis que l'intensité des pixels d'une vidéo ou d'une image numérique de scanner à huit bits est unlinéaire fonction avec 2 8 étapes. Il est devenu courant, bien qu'incorrect, de quantifier les gels, les fluorogrammes, les autoradiogrammes et les immunoblots simplement en termes d'intensité de pixel (ou d'intensité de pixel d'image inversée) de bandes ou de spots.Cela peut être valable si l'on inclut des normes dans chaque série ou exprime les intensités transmises ou réfléchies comparatives sur une échelle logarithmique, mais ce n'est que dans les images fluorescentes capturées numériquement que l'intensité des pixels est directement proportionnelle à la concentration.

La validité de l'approche utilisée ici est illustrée sur la figure 1 où un séparateur de faisceau linéaire standard a été scanné de manière conventionnelle de manière analogique avec un densitomètre à comptage de photons et également imagé numériquement avec une caméra CCD et un capteur d'images, convertissant l'intensité des pixels en OD mathématiquement. Les deux ensembles de données sont en excellent accord jusqu'à une DO d'environ 1,3, au-dessus de laquelle les limitations intrinsèques du signal vidéo sur bruit deviennent évidentes. Les mesures densitométriques quantitatives sont ordinairement limitées à des valeurs inférieures à 1 DO car ni la liaison du colorant ni la réponse du film n'est linéaire bien au-delà de ce point, ce qui rend cet écart de peu de conséquence pratique.

Fig. 1. Comparaison de la densitométrie analogique à comptage de photons et numérique basée sur la vidéo. Un diviseur de faisceau linéaire 0-2,0 OD (Edmund Scientific 41960, Edmund Scientific, Barrington, NJ) a été scanné avec un densitomètre Ortec 4310 (Ortec, Oak Ridge, TN), donnant une lecture OD directe, ainsi qu'avec un CCD COHU appareil photo et système JAVA, produisant une image numérique. L'intensité des pixels le long de l'axe du coin a été convertie en OD par la transformation OD = log (255/pixel intensité). Les deux méthodes n'ont dévié qu'à des valeurs de DO élevées, inférieures à une intensité de pixel de 10, où l'erreur due à la précision de la mesure (±1 valeur de pixel) devient progressivement plus importante.

La synthèse limitée des protéines architecturales se reproduit au cours des régénérations successives

La synthèse et l'utilisation de la tubuline et de la tektine-A ont été décrites (Stephens, 1991, 1994a), mais peu d'informations quantitatives sont disponibles pour d'autres protéines ciliaires, en particulier après de multiples régénérations. Après une déciliation riche en sel, S. droebachiensis les embryons régénèrent des cils complets en 8 h à 7,5 °C, et cette procédure peut être répétée à volonté (Stephens, 1977). Pour évaluer la synthèse protéique consécutive, les embryons ont d'abord été déciliés et marqués par pouls pendant la phase de croissance ciliaire quasi-linéaire de 4 heures. Après une chasse à la leucine non marquée pendant la fin de la croissance, les embryons ont été déciliés puis laissés se régénérer deux fois de plus. Pour détecter toute différence qui pourrait se produire dans la synthèse ou l'incorporation de protéines à différents endroits entourant ou dans la structure 9+2, les cils marqués ont d'abord été fractionnés en membrane solubilisée au détergent plus composants de matrice solubles, tubuline axonémale thermosolubilisée plus protéines associées, et des restes squelettiques stables neuf fois, comme le montre schématiquement la figure 2. Une analyse SDS-PAGE et fluorographique de ces fractions pour une régénération marquée et deux régénérations à froid est illustrée et quantifiée sur les figures 3 et 4.

Fig. 2. Le fractionnement d'un cil par solubilisation par un détergent (NP-40) de la membrane et de la matrice, suivi de la dépolymérisation thermique de la majeure partie de la tubuline de l'axonème 9+2, donne un résidu neuf fois qui conserve la plupart des protéines architecturales et un segment en forme d'aube du tubule A. Pour l'orientation spatiale, un tubule A partiellement dépolymérisé est montré sur le reste. [Basé sur les résultats de Stephens et al. (1989).]

Fig. 3. Analyse SDS-PAGE et 3H-fluorographique de protéines ciliaires synthétisées lors d'une régénération et remplacées par des protéines non marquées lors de deux régénérations successives. La membrane/matrice solubilisée par un détergent (M), la tubuline solubilisée thermiquement (T) et le reste stable neuf fois (R) ont été chargés de manière stoechiométrique, les indices indiquant les première, deuxième et troisième régénérations. Une protéine membranaire marquée bien en évidence est désignée par un astérisque les positions des chaînes lourdes de dynéine à peine résolues sont marquées (=) les chaînes de tubuline et sont ainsi désignées les pointes de flèches pleines marquent la tektine A.

Fig. 4. Densitométrie comparative du fluorogramme 3 H de la membrane/matrice, de la tubuline et des fractions résiduelles de la figure 3. Les traces de chaque panneau comparent les fractions désignées de la première (1), deuxième ( 2), et troisième (3) régénérations. Les données ont été normalisées pour les différences de chargement d'échantillons, et les traces 1 et 2 ont été déplacées verticalement de 0,40 et 0,20 unités de DO, respectivement, pour éviter les intersections. Les désignations des pics correspondent aux désignations des bandes de la figure 3. Les flèches (extrême gauche) marquent le matériau pénétrant à peine le haut de chaque gel.

L'inspection des fluorogrammes (Figure 3) révèle trois caractéristiques principales. Premièrement, le marqueur présent dans les deux principaux éléments constitutifs de l'axonème, la tubuline et la dynéine, n'a diminué que de façon minime avec les régénérations successives. Cela indique de grands pools marqués de ces protéines, auxquels les nouvelles protéines, synthétisées avec de la leucine non marquée, contribuent relativement peu. Deuxièmement, certaines protéines architecturales ont été uniformément remplacées dans les régénérations successives, indiquant des pools plus limités de ces constituants synthétisés de manière coordonnée. Troisièmement, de nombreuses protéines fortement marquées, en particulier dans la fraction restante, ont été presque entièrement remplacées après une seule régénération non marquée (la définition de la synthèse quantique).

La densitométrie comparative de chacune des trois fractions (figure 4) rend ces points plus apparents. Dans la fraction membrane/matrice, un matériau de poids moléculaire très élevé, pénétrant à peine dans le gel, et une importante protéine acylée de 190 kDa (Stephens, 1991) ont été fortement marqués lors de la première régénération (pulse-chase) mais ont été rapidement remplacés par des protéines contenant des protéines non marquées. leucine dans les deux régénérations successives, diminuant dans les deux cas de >80%. Un grand nombre des protéines mineures membranaires/matrices, dont peu correspondent en taille aux protéines architecturales marquées en évidence discutées ci-dessous, ont également diminué d'une quantité similaire. En revanche, les marqueurs des chaînes α et de la tubuline n'ont diminué de manière significative qu'après la deuxième régénération.

Dans la fraction de tubuline solubilisée thermiquement, le marqueur dans les chaînes de tubuline et et dans les chaînes lourdes comigrantes de dynéine a également été remplacé de manière minimale par des protéines non marquées. Le marqueur de la tubuline a légèrement augmenté dans la seconde régénération (puisque la première régénération les cils doivent utiliser de grands pools initialement non marqués) puis a diminué d'environ 20 % dans la troisième. Également élevée dans la deuxième régénération, la dynéine a diminué d'environ un tiers dans la troisième. Cependant, le marqueur dans de nombreuses protéines architecturales, en particulier celles qui migrent entre la dynéine et la tubuline, a diminué des deux tiers ou plus dans les deux régénérations non marquées, mais est resté apparent sous forme de pics sur la troisième trace de régénération.

Bien que représentant moins d'un tiers de la protéine totale du cil et ne retenant qu'environ un cinquième de la tubuline, le reste thermiquement stable, dans lequel se trouvent la plupart des protéines architecturales déterminantes 9+2, contenait plus de 40 % du marqueur . À l'exception d'une bande de poids moléculaire élevé identifiée par un anticorps spécifique de la chaîne lourde de la dynéine du bras interne (Stephens et Prior, 1995) et des chaînes de tubuline α et β résiduelles, de nombreuses protéines marquées ont diminué de >deux tiers au cours des régénérations successives. La protéine architecturale la plus marquée était la tektine-A, dont il a été démontré précédemment qu'elle était en corrélation avec l'allongement et la longueur. Son marqueur a diminué de >80 %, comme c'était également le cas pour un certain nombre d'autres protéines notées précédemment comme étant également potentiellement limitantes ou quantiques dans leur synthèse (Stephens, 1989). Ces protéines étaient à peine détectables sur la troisième trace de régénération.

L'inhibition de la colchicine de la synthèse ou de l'assemblage de la tubuline n'inhibe pas le renouvellement des protéines

Pour déterminer si le renouvellement est couplé à la synthèse ou à l'assemblage de tubuline, des sous-cultures ayant des cils vierges ont été traitées avec et sans colchicine pendant le marquage. La membrane/matrice, la tubuline axonémale et les fractions résiduelles de quantités équivalentes de cils ont été résolues sur le même gel, puis analysées par fluorographie (Figure 5).

Fig. 5. SDS-PAGE et analyse 3H-fluorographique de fractions de protéines ciliaires provenant d'embryons au stade midgastrula témoins et traités à la colchicine 1 mM. Panneau de gauche : gel coloré au bleu de Coomassie Panneau de droite : fluorogramme du même gel. La synthèse de la tubuline est inhibée par la colchicine, mais la distribution et le marquage des protéines sont similaires dans les deux conditions. La migration retardée dans les voies M est due à la présence d'hyaline, normalement éliminée lorsque les embryons sont prédéciliés pendant la culture, ce qui n'était pas intentionnel. Les désignations comme sur la figure 3 « < » désignent des protéines dont le marquage, mais pas la quantité, est diminué par la colchicine. Des protéines non ciliaires, non marquées provenant de la solubilisation à haute teneur en sel de la couche hyaline pendant la déciliation sont notées : h, hyalin y, un composant de granule vitelline.

Même en inhibant complètement la régénération ciliaire, le traitement à la colchicine 1 mM n'a entraîné aucune redistribution de la tubuline dans la fraction membrane/matrice (Figure 5, /β, coloration). Cette observation répond directement à la question de savoir si la tubuline associée à la membrane pourrait être dérivée d'une rupture de microtubules axonémaux assemblés ou récemment assemblés, circonstances dans lesquelles la colchicine devrait augmenter la proportion relative de tubuline dans la fraction soluble dans les détergents. Les proportions relatives et le marquage des autres protéines de la fraction membrane/matrice étaient qualitativement les mêmes dans les deux cas.

En présence de colchicine, aucun marquage significatif ne s'est produit dans la tubuline de la fraction membrane/matrice (Figure 5, /β, fluorogramme), et la tubuline axonémale elle-même n'a pas été marquée. Cependant, le marquage de la plupart des autres protéines axonémales majeures était similaire à celui du témoin, indiquant que la synthèse plus générale des protéines ciliaires n'était pas inhibée de manière marquée par un traitement à long terme à la colchicine. Cette conclusion a été confirmée pour l'embryon entier par la mesure directe de l'incorporation de [ 3 H]leucine dans la protéine totale précipitée par le TCA. Dans le cas illustré, il n'y avait pas d'inhibition de la synthèse dans la culture d'embryons traités à la colchicine par rapport à la culture d'embryons non traitée (16 270 cpm/mg contre 15 556 cpm/mg, respectivement), ni de différence dans l'absorption de [ 3 H]leucine (88,7 % contre 88,8 % du total des dénombrements ajoutés, respectivement).

L'incorporation dans la principale protéine architecturale marquée, la tektine A (figure 5, pointe de flèche), était également assez similaire, tout comme le modèle d'étiquetage qualitatif des autres composants architecturaux. Cependant, il y avait des différences quantitatives dans l'étiquetage, mais pas en quantité, dans certains de ces derniers (Figure 5, <). Ces différences de marquage ont été observées de manière constante dans trois analyses distinctes d'embryons à la fois au stade intermédiaire et au stade tardif de la gastrula.

Dans les cils régénérés, le marqueur protéique reflète directement la composition caractéristique de chaque fraction (Figure 3) mais pendant le renouvellement à l'état d'équilibre, la plupart des protéines marquées détectées dans la fraction de tubuline solubilisée thermiquement étaient plus caractéristiques de la fraction restante, c'est-à-dire le marquage global est dominé par des protéines nouvellement synthétisées qui sont destinées à être incorporées dans les éléments architecturaux de la structure 9+2 (Stephens, 1994a). Étant donné que ni la colchicine ni le traitement au taxol n'ont modifié cette distribution relative, d'autres expériences comparatives sont illustrées ci-dessous avec des axonèmes non fractionnés (c'est-à-dire 9+2).

La synthèse et le renouvellement se poursuivent en présence d'inhibiteurs de tubuline à action opposée

Pour comparer les actions de la colchicine et du taxol, le marquage des axonèmes de 1) régénéré, 2) témoin non traité et 3) embryons au stade tardif de la gastrula traités à la colchicine et 4) au taxol ont été examinés (Figure 6). Les valeurs d'absorption et d'incorporation pour les embryons de ces quatre conditions montrées étaient expérimentalement indiscernables, en moyenne 77,1 ± 1,1% et 19 002 ± 328 cpm/mg, respectivement (moyenne ± SD). Le fait que la synthèse protéique n'ait pas été significativement diminuée par la colchicine indiquerait que la nouvelle synthèse de tubuline doit représenter une très petite fraction de la synthèse protéique totale, du moins à ce stade tardif. Pour une comparaison plus poussée, les axonèmes d'embryons au stade midgastrula à l'état d'équilibre et traités à la colchicine, comme dans la figure 5, ont été inclus.

Fig. 6. SDS-PAGE et analyse fluorographique 3 H des axonèmes ciliaires de cultures parallèles de Régénéré,Régime permanent contrôle, et 1 mM Colchicine- ou 10 µM Taxol-traités d'embryons au stade tardif de la gastrula et deRégime permanent contrôle et 1 mM Colchicine-des embryons au stade midgastrula traités. Panneau de gauche : gel coloré au bleu de Coomassie Panneau de droite : fluorogramme du même gel. Les schémas de marquage sont similaires entre le contrôle et les conditions traitées à la colchicine ou au taxol, mais les deux médicaments provoquent une diminution similaire du marqueur dans certaines protéines. Les désignations comme dans les figures 3 et 5 "> et <" marquent les mêmes protéines que la figure 5.

Par rapport au témoin à l'état d'équilibre, le marquage des cils régénérés à partir d'embryons au stade tardif de la gastrula était relativement élevé puisque la déciliation régule à la hausse le taux de synthèse des protéines ciliaires supprimées au stade mieux que double (Harlow et Nemer, 1987 Stephens, 1991). Dans les embryons au stade midgastrula, le taux de synthèse à l'état d'équilibre est caractéristiquement élevé, un fait qui est évident si l'on compare les contrôles aux stades tardif et midgastrula (Figure 6, état stable vs.Régime permanent). Indépendamment de ces différences, le même schéma d'étiquetage global prévalait.

Le degré relatif et le modèle qualitatif de marquage de la plupart des protéines autres que la tubuline étaient similaires chez les témoins à l'état d'équilibre non traités par rapport aux cas traités à la colchicine ou au taxol. Ceci est particulièrement évident lorsque l'on compare la tektine-A parmi les voies 2 à 4 de la figure 6. Les protéines architecturales susmentionnées dont le marquage relatif a été diminué par la colchicine ont été affectées de la même manière par le taxol. En comparaison avec les bandes flanquantes, bon nombre de ces mêmes protéines sont plus fortement marquées dans les cils régénérés que dans les cils à l'état d'équilibre, indiquant une régulation à la hausse disproportionnée en réponse à la déciliation expérimentale (Figure 6, > vs <).

Contrairement à la colchicine, le taxol n'inhibe pas la synthèse de la tubuline (Gong et Brandhorst, 1988), vérifié par l'observation du marquage de la tubuline au niveau contrôle dans la fraction membrane/matrice. Dans l'exemple illustré, le marquage de la -tubuline dans les axonèmes des embryons traités au taxol était de 51 % du témoin à l'état d'équilibre alors que les architectes étaient en moyenne d'environ 70 %, comparable à la réduction observée avec la colchicine.

La plupart des protéines axonémales sont marquées proportionnellement pendant le traitement à la colchicine

Sans tenir compte de l'inhibition de la synthèse de la tubuline, le degré de marquage (activité spécifique) des axonèmes ciliaires en présence de colchicine était d'environ 20 % inférieur au stade tardif de la gastrula et jusqu'à un tiers inférieur au stade midgastrula. Le rendement des cils à chaque stade était en corrélation avec la diminution observée du marquage, compatible avec l'inhibition par la colchicine (et le taxol) de la division cellulaire et de la repousse subséquente des cils sur les blastomères filles résultants. Ainsi, la diminution de l'étiquetage reflète très probablement cette fraction de cils non assemblés au cours de la période de temps, et, par conséquent, toute étiquette restante qui est incorporée doit refléter un véritable renouvellement.

Lorsque des traces de densitomètre de fluorogrammes d'axonèmes d'embryons non traités et traités à la colchicine sont comparées directement, la synthèse proportionnelle de la plupart des composants axonémiques, y compris les chaînes lourdes de la dynéine, devient plus apparente. Des traces représentatives, illustrées à la figure7, ont été prises à partir de la midgastrulaRégime permanent et Colchicine voies de la figure 6. Ces données ont été normalisées par rapport aux différences d'incorporation notées ci-dessus. Seules la α- et la -tubuline (cette dernière migrant légèrement avant la tektine-A et donc masquée par son lourd marqueur) étaient essentiellement non marquées, tandis que les protéines architecturales mentionnées ci-dessus dans les cils d'embryons traités à la colchicine contenaient de manière disproportionnée moins de marqueurs que les témoins non traités.

Fig. 7. La densitométrie comparative démontre le marquage stoechiométrique de la plupart des protéines ciliaires malgré l'inhibition par la colchicine de la synthèse de la tubuline. Les deux dernières voies de la figure 5 ont été balayées, normalisées par un facteur de 1,30 pour la différence des nombres totaux de nontubuline, et tracées ensemble. Les flèches désignent les protéines dont le marquage a été diminué par le traitement à la colchicine, comme indiqué sur la figure 5.

Ni la colchicine ni le taxol n'influencent la distribution d'un parent chaperon moléculaire

La découverte d'un chaperon moléculaire dans Chlamydomonasflagella par Bloch et Johnson (1995) leur a suggéré que le chaperon pourrait être impliqué dans le ciblage de la tubuline et d'autres composants 9+2 non assemblés vers le cil pour l'assemblage. En raison du renouvellement à l'état d'équilibre, il est important de savoir si une molécule similaire est présente dans les cils embryonnaires d'oursin et si l'inhibition de la régénération par la colchicine ou le taxol influence sa présence ou sa distribution.

Les axonèmes des embryons de contrôle à l'état d'équilibre, de colchicine et de taxol arrêtés au stade tardif de la gastrula ont été fractionnés thermiquement en tubuline soluble et en restes insolubles neuf fois et comparés stœchiométriquement avec l'extrait de membrane/matrice soluble dans le détergent initial par SDS-PAGE et immunoblot, en utilisant anticorps monoclonaux de souris (3a3) ou de rat (7.10) dirigés contre l'homme ou Drosophile HSP70, respectivement. Une telle comparaison avec l'anticorps monoclonal 7.10 est illustrée à la figure 8.

Fig. 8. L'analyse par immunotransfert de fractions de protéines ciliaires d'embryons témoins et traités à la colchicine au stade tardif de la gastrula à l'aide de l'anticorps monoclonal 7.10 dirigé contre les chaperons moléculaires de la famille HSP70 montre que la localisation d'un parent de 78 kDa à HSP70 est très peu affectée par la colchicine traitement, mais son montant total est supérieur. L'anticorps a également réagi de manière croisée avec une protéine axonémale de 46 kDa. Les axonèmes non fractionnés d'origine qui ont donné ces échantillons sont représentés sur la figure 6, voies 2 et 3, respectivement.

Cet anticorps a détecté une seule protéine de 78 kDa dans les trois fractions, tout comme le monoclonal 3a3, mais le monoclonal 7.10 a également présenté une réaction croisée avec une protéine de 46 kDa trouvée principalement dans la fraction restante. (Un autre oursin, Tripneustes gratillas, n'avait que la protéine de 78 kDa, de sorte que la présence d'un antigène de 46 kDa n'est pas caractéristique des oursins.) Région de 55 kDa. Bien que le poids moléculaire du composant principal coïncide avec celui de certaines protéines KDEL (Grp78 ou BiP), un anticorps à large spectre dirigé contre l'épitope KDEL (StressGen SPA-827, StressGen Biotech, Victoria, Colombie-Britannique, Canada) a réagi de manière croisée avec ni protéine.

Contrairement aux attentes basées sur la ciliogenèse de fond ou le transport médié par les microtubules, ni l'inhibition par la colchicine de la synthèse et de l'assemblage de la tubuline, ni la promotion du taxol de l'assemblage de la tubuline n'ont diminué la quantité de HSP70 apparenté ou modifié de manière marquée sa distribution. Au contraire, la quantification de cette analyse et de deux autres a indiqué qu'il y avait généralement 40 à 50 % plus d'antigène total HSP70 dans les cils des embryons traités à la colchicine que dans les témoins non traités.Cependant, les distributions de cet antigène dans la membrane/matrice, la tubuline solubilisée et les fractions résiduelles étaient similaires : 59 %, 11 % et 30 % chez le témoin et 55 %, 19 % et 26 % dans le cas traité à la colchicine. illustré ici. Il y avait systématiquement 8 à 11 % plus d'antigène total HSP70 dans les cils des embryons traités au taxol que chez les témoins. La distribution était de 57 %, 19 % et 24 % dans la membrane/matrice, la tubuline solubilisée et les fractions résiduelles, respectivement. Malgré leurs modes d'action opposés, la colchicine et le taxol ont presque doublé la quantité de HSP70 apparenté qui a été libérée de l'axonème par chauffage mais, indépendamment de toute différence dans l'antigène total ou thermiquement libéré, la fraction qui était initialement associée à l'axonème était de 41 à 45 % dans les trois conditions d'incubation.

Le chaperon lié est proportionnel à la longueur pendant la régénération

La simple présence d'un parent HSP70 dans les cils à l'état d'équilibre ne dit rien sur son comportement au cours de la ciliogenèse. Si une telle protéine est associée le long du cil, la quantité dans la fraction d'axonème devrait être en corrélation avec la longueur à mesure que l'axonème s'allonge pendant la régénération. En revanche, si le parent HSP70 est principalement associé à la pointe (Block et Johnson, 1995), un montant fixe par axonème serait attendu. Pour évaluer ces points, les embryons ont été déciliés et autorisés à régénérer des cils de longueur variable. Les cils ont été prélevés, démembranés pour produire des fractions membrane/matrice et axonème, et analysés par immunoblot quantitatif. La quantité de protéine de 78 kDa dans chaque fraction, exprimée par rapport à l'antigène dans les cils à l'état d'équilibre avant la déciliation, est illustrée sur la figure 9.

Fig. 9. Temps après la déciliation par rapport à la quantité de HSP70 apparenté trouvée dans les cils entiers (cercles/carrés vides) et associée à l'axonème (cercles/carrés pleins) par rapport à la quantité totale d'antigène trouvée dans les cils à l'état d'équilibre avant déciliation, prise égale à 100 %. Les deux ensembles de symboles représentent deux expériences indépendantes (monoclonal 7.10). La quantité de HSP70 apparenté dans les cils entiers est presque constante tandis que la quantité associée à l'axonème augmente parallèlement à la longueur ciliaire (triangles/ligne).

La quantité totale de HSP70 apparenté à partir d'un nombre donné de cils pendant la régénération est restée relativement constante et ne différait pas de celle trouvée à l'état d'équilibre avant la déciliation (99,9 ± 7,7 SD, n = 15). Cependant, la fraction de cette quantité totale qui était associée aux axonèmes augmentait régulièrement parallèlement à l'allongement, dépassant finalement celle trouvée avant la déciliation. La fraction membrane-matrice contenait mieux que les deux tiers de la protéine de 78 kDa lorsque les cils étaient à moitié cultivés, mais elle en représentait moins de la moitié lorsqu'ils ont atteint leur longueur finale. (Des longueurs plus courtes n'ont pas été analysées en raison d'une diminution du rendement et d'une augmentation de la contamination potentielle.)


Contenu

En 1978, David Galas et Albert Schmitz ont développé la technique d'empreinte ADN pour étudier la spécificité de liaison de la protéine répresseur lac. Il s'agissait à l'origine d'une modification de la technique de séquençage chimique de Maxam-Gilbert. [1]

L'application la plus simple de cette technique est d'évaluer si une protéine donnée se lie à une région d'intérêt au sein d'une molécule d'ADN. [2] La réaction en chaîne par polymérase (PCR) amplifie et marque la région d'intérêt qui contient un site potentiel de liaison aux protéines, idéalement l'amplicon a une longueur comprise entre 50 et 200 paires de bases. Ajouter la protéine d'intérêt à une partie de l'ADN matrice marquée, une partie doit rester séparée sans protéine, pour une comparaison ultérieure. Ajouter un agent de clivage aux deux parties de la matrice d'ADN. L'agent de clivage est un produit chimique ou une enzyme qui coupera à des emplacements aléatoires d'une manière indépendante de la séquence. La réaction doit se produire juste assez longtemps pour couper chaque molécule d'ADN en un seul endroit. Une protéine qui se lie spécifiquement à une région dans la matrice d'ADN protégera l'ADN auquel elle est liée de l'agent de clivage. Exécuter les deux échantillons côte à côte sur une électrophorèse sur gel de polyacrylamide. La portion de matrice d'ADN sans protéine sera coupée à des emplacements aléatoires, et donc lorsqu'elle est exécutée sur un gel, produira une distribution semblable à une échelle. La matrice d'ADN avec la protéine entraînera une distribution en échelle avec une rupture, l'« empreinte », où l'ADN a été protégé de l'agent de clivage. Remarque : Le séquençage de l'ADN chimique Maxam-Gilbert peut être exécuté avec les échantillons sur le gel de polyacrylamide pour permettre la prédiction de l'emplacement exact du site de liaison du ligand.

Étiquetage Modifier

La matrice d'ADN marquée à l'extrémité 3' ou 5', selon l'emplacement du ou des sites de liaison. Les marqueurs utilisables sont : la radioactivité et la fluorescence. La radioactivité a été traditionnellement utilisée pour marquer les fragments d'ADN pour l'analyse de l'empreinte, car la méthode a été développée à l'origine à partir de la technique de séquençage chimique de Maxam-Gilbert. Le marquage radioactif est très sensible et est optimal pour visualiser de petites quantités d'ADN. La fluorescence est une avancée souhaitable en raison des dangers de l'utilisation de produits radiochimiques. Cependant, il a été plus difficile à optimiser car il n'est pas toujours assez sensible pour détecter les faibles concentrations des brins d'ADN cibles utilisés dans les expériences d'empreinte ADN. Les gels de séquençage électrophorétique ou l'électrophorèse capillaire ont réussi à analyser l'empreinte de fragments fluorescents marqués. [2]

Agent de clivage Modifier

Une variété d'agents de clivage peut être choisie. un agent souhaitable est celui qui est neutre dans la séquence, facile à utiliser et facile à contrôler. Malheureusement, aucun agent disponible ne répond à toutes ces normes, un agent approprié peut donc être choisi, en fonction de votre séquence d'ADN et du ligand d'intérêt. Les agents de clivage suivants sont décrits en détail : La DNase I est une grande protéine qui fonctionne comme une endonucléase double brin. Il se lie au petit sillon de l'ADN et clive le squelette phosphodiester. C'est un bon agent de clivage pour l'empreinte car sa taille le rend facilement gêné physiquement. Ainsi, il est plus probable que son action soit bloquée par une protéine liée à une séquence d'ADN. De plus, l'enzyme DNase I est facilement contrôlée en ajoutant de l'EDTA pour arrêter la réaction. Il existe cependant certaines limitations dans l'utilisation de la DNase I. L'enzyme ne coupe pas l'ADN au hasard, son activité est affectée par la structure et la séquence locales de l'ADN et entraîne donc une échelle inégale. Cela peut limiter la précision de la prédiction du site de liaison d'une protéine sur la molécule d'ADN. [2] [3] Les radicaux hydroxyles sont créés à partir de la réaction de Fenton, qui consiste à réduire Fe 2+ avec H2O2 pour former des molécules hydroxyles libres. Ces molécules d'hydroxyle réagissent avec le squelette de l'ADN, entraînant une rupture. En raison de leur petite taille, l'empreinte ADN résultante a une haute résolution. Contrairement à la DNase I, ils n'ont aucune dépendance de séquence et aboutissent à une échelle beaucoup plus uniformément répartie. L'aspect négatif de l'utilisation des radicaux hydroxyles est qu'ils prennent plus de temps à utiliser, en raison d'une réaction et d'un temps de digestion plus lents. [4] L'irradiation ultraviolette peut être utilisée pour exciter les acides nucléiques et créer des photoréactions, ce qui entraîne des bases endommagées dans le brin d'ADN. [5] Les photoréactions peuvent inclure : des cassures à un seul brin, des interactions entre ou à l'intérieur des brins d'ADN, des réactions avec des solvants ou des liaisons croisées avec des protéines. Le flux de travail de cette méthode comporte une étape supplémentaire, une fois que votre ADN protégé et non protégé a été traité, il y a une extension d'amorce ultérieure des produits clivés. [6] [7] L'extension se terminera en atteignant une base endommagée, et donc lorsque les produits PCR sont exécutés côte à côte sur un gel, l'échantillon protégé montrera une bande supplémentaire où l'ADN a été réticulé avec une protéine liée. L'avantage de l'utilisation des UV est qu'ils réagissent très rapidement et peuvent donc capter des interactions qui ne sont que momentanées. De plus, il peut être appliqué à in vivo expériences, car les UV peuvent pénétrer les membranes cellulaires. Un inconvénient est que le gel peut être difficile à interpréter, car la protéine liée ne protège pas l'ADN, elle modifie simplement les photoréactions à proximité. [8]

In vivo Empreinte Modifier

In vivo L'empreinte est une technique utilisée pour analyser les interactions protéine-ADN qui se produisent dans une cellule à un moment donné. [9] [10] La DNase I peut être utilisée comme agent de clivage si la membrane cellulaire a été perméabilisée. Cependant, l'agent de clivage le plus couramment utilisé est l'irradiation UV car il pénètre la membrane cellulaire sans perturber l'état cellulaire et peut ainsi capturer des interactions sensibles aux changements cellulaires. Une fois que l'ADN a été clivé ou endommagé par les UV, les cellules peuvent être lysées et l'ADN purifié pour l'analyse d'une région d'intérêt. La PCR par ligature est une méthode alternative à l'empreinte in vivo. Une fois qu'un agent de clivage a été utilisé sur l'ADN génomique, entraînant des cassures simple brin, et que l'ADN est isolé, un lieur est ajouté sur les points de cassure. Une région d'intérêt est amplifiée entre le lieur et une amorce spécifique d'un gène, et lorsqu'elle est exécutée sur un gel de polyacrylamide, elle aura une empreinte où une protéine était liée. [11] In vivo L'empreinte combinée à l'immunoprécipitation peut être utilisée pour évaluer la spécificité des protéines à de nombreux endroits du génome. L'ADN lié à une protéine d'intérêt peut être immunoprécipité avec un anticorps dirigé contre cette protéine, puis la liaison à une région spécifique peut être évaluée à l'aide de la technique d'empreinte ADN. [12]

Empreinte quantitative Modifier

La technique d'empreinte ADN peut être modifiée pour évaluer la force de liaison d'une protéine à une région de l'ADN. En utilisant des concentrations variables de la protéine pour l'expérience d'empreinte, l'apparence de l'empreinte peut être observée à mesure que les concentrations augmentent et l'affinité de liaison des protéines peut alors être estimée. [2]

Détection par électrophorèse capillaire Modifier

Pour adapter la technique d'empreinte aux méthodes de détection mises à jour, les fragments d'ADN marqués sont détectés par un appareil d'électrophorèse capillaire au lieu d'être exécutés sur un gel de polyacrylamide. Si le fragment d'ADN à analyser est produit par amplification en chaîne par polymérase (PCR), il est simple de coupler une molécule fluorescente telle que la carboxyfluorescéine (FAM) aux amorces. De cette façon, les fragments produits par digestion DNaseI contiendront FAM, et seront détectables par la machine d'électrophorèse capillaire. Typiquement, des étalons de taille marqués à la carboxytétraméthyl-rhodamine (ROX) sont également ajoutés au mélange de fragments à analyser. Les sites de liaison des facteurs de transcription ont été identifiés avec succès de cette manière. [13]

Le séquençage de nouvelle génération a permis une approche à l'échelle du génome pour identifier les empreintes génétiques. Les dosages ouverts de la chromatine tels que DNase-Seq [14] et FAIRE-Seq [15] se sont avérés fournir un paysage réglementaire robuste pour de nombreux types de cellules. [16] Cependant, ces tests nécessitent des analyses bioinformatiques en aval afin de fournir des empreintes d'ADN à l'échelle du génome. Les outils de calcul proposés peuvent être classés en deux classes : les approches basées sur la segmentation et les approches centrées sur le site.


Clivage médié par les ribozymes du transcrit de l'oncogène BCRABL : clivage in vitro de l'ARN et perte in vivo de l'activité protéine-kinase P210

La translocation chromosomique t(9,22) générant le chromosome Philadelphie et l'oncogène BCRABL s'est avérée à la fois cytogénétique et moléculairement l'événement étiologique dans la leucémie myéloïde chronique (LMC). Nous avons conçu un ribozyme pour cliver l'ARNm de BCRABL en ciblant un triplet GUU adjacent à la jonction des gènes fusionnés c-BCR et c-ABL. Ce ribozyme a clivé efficacement les transcrits d'ARN de BCRABL comme démontré par des réactions de clivage in vitro. Pour déterminer l'effet de l'expression constitutive du ribozyme sur l'élimination du produit du gène BCRABL, la séquence d'ADNc du ribozyme a été insérée dans différents vecteurs d'expression rétroviraux. L'introduction des rétrovirus recombinants dans la lignée cellulaire de crise blastique de la LMC K562, a entraîné l'élimination de l'activité protéine-kinase P210 dans plusieurs clones monocellulaires infectés avec la cassette d'expression du ribozyme. Par conséquent, les ribozymes spécifiques de BCR-ABL peuvent fournir une thérapie génétique potentielle pour la LMC.


DISCUSSION

La majorité des protéines pAgo précédemment caractérisées étaient dérivées d'espèces bactériennes et archéennes thermophiles et sont donc actives de manière optimale à haute température. Dans cette étude, nous présentons une caractérisation détaillée des protéines pAgo de bactéries mésophiles C. butyricum et L. rosea. Nous montrons que CbAgo et LrAgo sont des endonucléases actives qui peuvent être programmées avec de petits guides d'ADN pour traiter les substrats d'ADN cibles avec une grande précision à des températures modérées. Ci-dessous, nous comparons les propriétés de CbAgo et LrAgo et suggérons qu'ils peuvent être utilisés pour le développement d'outils pour la manipulation de l'ADN in vitro et in vivo.

CbAgo et LrAgo sont de longs pAgos catalytiquement actifs contenant la tétrade catalytique DEDD complète dans leurs domaines PIWI. Ils effectuent un découpage précis guidé par l'ADN des substrats d'ADNsb in vitro à une large gamme de températures (de 30 à 60°C pour CbAgo), et préfèrent Mn 2+ comme ion catalytique. CbAgo est significativement plus rapide que LrAgo à 37°C et révèle une activité spécifique plus élevée lorsqu'il agit sur des substrats d'ADN double brin. Sur la base de ces propriétés et d'autres décrites ci-dessous, CbAgo apparaît comme un candidat prometteur pour diverses applications génomiques.

Guider la liaison à l'ADN et le clivage de la cible ADNsb par CbAgo et LrAgo

CbAgo et LrAgo se lient à de petits guides d'ADN avec des affinités exceptionnellement élevées, avec Ks dans la gamme picomolaire. Cela dépasse nettement les affinités précédemment rapportées pour d'autres pAgos (par ex. Ks de 3 nM pour MjAgo, 1 nM pour RsAgo) (17, 46). CbAgo et LrAgo ne montrent aucune préférence évidente envers le nucléotide guide 5' pendant le clivage de la cible, indiquant que les deux protéines peuvent être programmées avec des guides d'ADN de n'importe quelle séquence permettant un choix flexible du site cible. L'efficacité du clivage de l'ADN par CbAgo et LrAgo est considérablement réduite si la longueur du guide est inférieure à 16 nucléotides. Cependant, un tranchage de cible lent peut toujours être observé avec des guides plus courts, jusqu'à 10 nt pour LrAgo, lorsque la liaison scissile n'est pas flanquée de nucléotides appariés à des bases. En comparaison, la longueur la plus courte du duplex guide-cible requise pour le clivage de la cible par fly RISC était de 12 pb, bien que l'efficacité du clivage de l'ARN ait été considérablement diminuée avec cette longueur de guide (26). De la même manière que LrAgo, il a été démontré que TtAgo utilisait des guides d'ADN de 9 à 10 nt pour le clivage de l'ADN cible, mais cette activité a disparu à des températures élevées (9). Ainsi, l'appariement des bases autour de la position de clivage aide probablement à stabiliser la liaison cible dans le site actif des protéines Ago.

Contrairement aux autres Agos étudiés, CbAgo et LrAgo sont capables d'utiliser des guides 5'-OH pour le clivage de la cible avec presque la même efficacité que les guides 5'-P. Il a été rapporté que la majorité des eAgos et pAgos utilisaient des guides 5'-P, et des contacts multiples entre le groupe 5'-P et la poche de liaison 5' dans le domaine MID sont observés dans les structures de plusieurs complexes binaires Ago-guide ( Figure 4A) (17, 18, 20, 21, 39-41). Une exception notable est le MpAgo guidé par l'ARN qui se lie exclusivement aux guides 5'-OH (7), et plusieurs autres pAgos devraient avoir une poche de liaison 5' similaire (4, 7). Fait intéressant, bien que eAgos s'associe universellement aux guides 5′-P in vivo, il a été démontré que l'Ago2 humain coupe les cibles d'ARNm lorsqu'il est lié à de petits guides d'ARN non phosphorylés in vitro ( 47), suggérant que la capacité de diverses protéines Ago à utiliser des guides non phosphorylés pourrait être sous-explorée.

Notre récente analyse bioinformatique a révélé plusieurs sous-types du domaine MID avec des substitutions de résidus clés impliqués dans les interactions avec le groupe 5' de la molécule guide (4), la plupart d'entre eux n'ont pas été caractérisés expérimentalement. Par rapport à TtAgo, CbAgo et LrAgo contiennent des substitutions de deux résidus conservés dans la poche de liaison à l'extrémité 5' (figure 4A). Cependant, ces substitutions sont également présentes dans RsAgo qui s'est avéré reconnaître les molécules guides 5'-phosphorylées, de manière similaire à TtAgo (12). En outre, la modélisation structurelle basée sur l'homologie suggère que les interactions de l'extrémité 5' du guide avec la poche MID sont globalement très similaires pour TtAgo et LrAgo (figure 4A). Ainsi, des contacts avec d'autres parties de la molécule guide peuvent compenser la perte d'interactions avec le 5'-phosphate dans LrAgo et CbAgo. Pourtant, les interactions avec le 5'-phosphate peuvent stabiliser les complexes dans des conditions sous-optimales, telles qu'une température accrue, comme cela a été démontré pour CbAgo qui n'est pas capable d'utiliser des guides 5'-OH pour couper des cibles à 55°C.

Dans le cas de LrAgo, le site de clivage est déplacé de 1 à 2 nucléotides en aval de l'extrémité 5' du guide en l'absence du groupe 5'-phosphate dans la molécule guide. Des changements dans la position de tranchage ont également été observés pour hAgo2 avec des guides non phosphorylés (47). De tels changements pourraient être provoqués par le glissement du duplex guide-cible dans le site actif en l'absence des interactions 5'-P-MID. Fait intéressant, MjAgo a également démontré un clivage de l'ADN cible non canonique à plusieurs positions autour du site de clivage canonique, suggérant que le duplex guide-cible peut être lié dans plusieurs registres dans le cas de ce pAgo (11, 21, 23). Le rôle des interactions 5'-P-MID dans le positionnement des guides dans MjAgo reste à établir. Nos résultats indiquent que le guide 5'-phosphate peut aider à déterminer le bon registre du duplex guide/cible par rapport au site actif de pAgo.

Les taux de clivage de l'ADN simple brin par les complexes ternaires de CbAgo et LrAgo sont plus lents que les taux de clivage de l'ARNm mesurés pour le complexe RISC de mouche ou de souris (kobs de 0,0071 s -1 , ou 0,426 min -1 ) (26). Dans le même temps, de manière similaire à l'eAgos précédemment étudié (24-26), le taux de catalyse à renouvellement multiple par CbAgo est probablement limité à l'étape de dissociation du produit après le clivage de l'ADN cible. LrAgo se distingue de CbAgo et eAgos par l'absence d'éclatement lors du clivage de l'ADN à rotations multiples, ce qui suggère que la formation de complexes catalytiques et/ou le clivage de la cible, mais pas la dissociation du produit, peuvent limiter la vitesse de ce pAgo.

Des études antérieures sur eAgos et pAgos ont démontré l'importance de la complémentarité entre le guide et la cible pour une répression efficace : les mésappariements dans la région germe réduisent généralement la répression, tandis que les mésappariements dans la partie 3' (en aval du site de clivage) sont tolérés sans perte significative. d'efficacité (9, 17, 22, 24, 27, 42-45). En comparaison avec ces études, les mésappariements entre les molécules guide et cible ont des effets inhabituels sur le clivage de la cible par CbAgo et LrAgo. Les mésappariements dans la région de la graine n'affectent pas de manière significative (pour CbAgo) ni même ne stimulent (pour LrAgo) le clivage de l'ADN cible. Fait intéressant, une analyse récente de zAgo2 de poisson zèbre a démontré qu'il était inactif avec des cibles parfaitement complémentaires, mais un décalage dans la région de la graine a stimulé le clivage de l'ARN cible (48). Les mésappariements dans la région de la graine peuvent éventuellement affecter le positionnement de la cible et/ou les changements de conformation dans le site actif de zAgo2 et LrAgo pendant la catalyse.En effet, l'analyse cinétique à rotation unique a démontré que les mésappariements dans la graine peuvent augmenter le taux de catalyse dans le complexe ternaire de LrAgo. Des études structurelles de pAgos ont révélé que l'un des résidus du site actif, le glutamate catalytique, est débranché dans pAgos libre et doit être branché pour la liaison catalytique au métal et le clivage de la liaison scissile après la liaison cible (14, 19, 37). On peut supposer que cette ou d'autres étapes d'isomérisation peuvent être affectées par des mésappariements entre les brins guide et cible dans le complexe.

Globalement, les modifications de la complémentarité guide-cible peuvent avoir des effets divers sur la catalyse par pAgos. Les mésappariements dans la région d'ensemencement peuvent favoriser le clivage de l'ADN cible, en stimulant l'étape catalytique de la réaction et, éventuellement, en augmentant la vitesse de dissociation du produit, mais peuvent également diminuer la vitesse de formation du complexe catalytique. Contrairement à la plupart des autres protéines Ago étudiées à ce jour, des mésappariements dans la région de guidage supplémentaire 3' inhibent fortement le clivage de l'ADN cible par CbAgo et LrAgo. Des effets similaires ont été récemment rapportés pour TtAgo (31). Par conséquent, dans le cas de ces pAgos, la propagation du duplex guide-cible, plutôt que les interactions initiales dans la région germe, peut contrôler la fidélité de la reconnaissance de la cible. Une analyse cinétique plus approfondie est nécessaire pour déchiffrer le mécanisme catalytique complet des deux pAgos et pour comprendre pleinement les effets observés des changements dans la structure du guide sur le clivage de l'ADN cible.

Clivage de l'ADN double brin par CbAgo et LrAgo

CbAgo et LrAgo peuvent détendre l'ADN plasmidique superenroulé d'une manière indépendante du guide, probablement en logeant les deux brins d'ADN dans la fente catalytique pour l'entaille simple brin. La relaxation plasmidique est suivie d'un traitement lent de l'ADN plasmidique, entraînant sa linéarisation et une dégradation supplémentaire, correspondant à l'activité de «coupage» précédemment décrite pour TtAgo et MjAgo (11, 28). L'activité de hachage peut compliquer l'utilisation de pAgos comme outils d'édition du génome spécifiques, comme cela a été récemment discuté pour TtAgo et NgAgo (pAgo de Natronobacterium gregoryi) ( 31). Cependant, l'activité de hachage de CbAgo est nettement supprimée s'il est préchargé avec des molécules de guidage. En outre, le traitement plasmidique indépendant du guide est supprimé à de faibles concentrations de CbAgo et LrAgo, peut-être en raison de leur liaison inefficace à l'ADNdb dans ces conditions.

CbAgo et LrAgo peuvent couper avec précision l'ADNdb sur un ou plusieurs sites lorsqu'ils sont programmés avec les guides correspondants. Cela ouvre la voie au développement de nouveaux outils basés sur pAgo pour les manipulations d'ADN in vitro et in vivo. Les tentatives précédentes d'utiliser des pAgos thermophiles, tels que PfAgo ou TtAgo, en tant que nucléases programmables étaient limitées par leur faible activité à température ambiante, ce qui nécessitait de chauffer les échantillons avec une dénaturation concomitante de l'ADN (13, 29). Nous avons montré que les pAgos mésophiles peuvent cibler des sites spécifiques dans l'ADN plasmidique à des températures plus basses, avec une faible efficacité à 37°C (CbAgo uniquement) et avec une efficacité élevée à 55°C (à la fois CbAgo et LrAgo) - la température compatible avec de nombreux in vitro applications. Le clivage plasmidique le plus efficace a été observé pour les régions riches en AT, mais il était également détectable pour les régions cibles avec une teneur en GC plus élevée (jusqu'à 50 % de GC pour CbAgo).

Une application évidente est l'utilisation de pAgos mésophiles dans la technologie de l'ADN recombinant, par analogie avec les endonucléases de restriction mais avec la capacité potentielle de cibler n'importe quel site d'intérêt. Contrairement aux endonucléases de restriction et Cas9, pAgo dirigé par un guide ne peut couper qu'un seul brin d'ADN dans le duplex d'ADNdb. Par conséquent, deux brins d'ADN peuvent être ciblés par pAgo chargé de deux guides indépendamment, de sorte que des extrémités «collantes» de toute configuration souhaitée peuvent être produites. Contrairement aux nucléases Cas, CbAgo ou LrAgo ne nécessitent pas la présence de motifs spécifiques (tels que PAM, motif adjacent au protospacer) dans le guide ou les ADN cibles qui peuvent permettre le ciblage de l'ADN avec une résolution d'un seul nucléotide. De plus, les oligonucléotides d'ADN courts utilisés par CbAgo et LrAgo comme molécules guides sont beaucoup plus faciles à synthétiser par rapport aux guides d'ARN plus longs requis pour les nucléases Cas.

Les problèmes importants qui doivent être résolus pour permettre l'utilisation de pAgos dans les technologies génétiques telles que l'édition du génome comprennent la recherche de conditions qui permettraient un chargement de guide spécifique et un ciblage efficace de l'ADNdb de n'importe quelle séquence, de préférence indépendamment de son contenu en AT, in vivo dans les cellules eucaryotes. Contrairement aux complexes Cascade et aux nucléases Cas des systèmes CRISPR, les pAgos ne déroulent pas l'ADNdb. En effet, il a été récemment montré que le clivage de l'ADN par TtAgo était stimulé par l'hélicase SSB ou UvrD (49). De plus, le surenroulement négatif de l'ADN pourrait faciliter la formation de complexes pAgo ternaires dans des régions plasmidiques ou génomiques déroulées localement (8, 13). Analyse de in vivo Le traitement de l'ADN par les pAgos mésophiles et sa dépendance vis-à-vis de diverses activités cellulaires seront un objectif important des futures études.


Voir la vidéo: BIOLOGIE CELLULAIRE PARTIE PROTEINE (Février 2023).